藏藥水母雪蓮黃酮類抗腫瘤免疫效應的初步研究

張燕麗 岳秋娟 陳香君 張敏

摘要：目的 初步探討藏藥水母雪蓮SMM（Saussurea medusa Maxim）的抗腫瘤免疫功能，為進一步開發水母雪蓮藥用價值提供科學依據。方法 建造lewis荷瘤小鼠模型后，隨機分為生理鹽水組（normal saline，NS）、SMM黃酮類組和環磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）組，體外治療14天。以lewis荷瘤小鼠腫瘤組織HE形態染色以及血清中IL-2和IFN-γ為檢測指標。結果 lewis荷瘤小鼠經SMM黃酮類提取物治療后，腫瘤浸潤組織部位的腫瘤細胞出現局灶性或者片狀壞死并伴有新生血管形成;還提高了荷瘤小鼠血清中IL2和IFN-γ的含量。結論 水母雪蓮黃酮類提取物有一定抗肺癌免疫治療的效應。

關鍵字：水母雪蓮;抗腫瘤效應

[Abstract] Objective To preliminarily explore the anti-tumor immune function of Saussurea medusa Maxim （Saussurea medusa Maxim）， and provide scientific basis for further development of the medicinal value of Saussurea medusa Maxim. Methods After the lewis tumor-bearing mouse model was constructed， they were randomly divided into normal saline ， SMM flavonoids and cyclophosphamide groups. They were treated in vitro for 14 days.The HE morphological staining of tumor tissue and serum IL-2 and IFN-γ in Lewis tumor-bearing mice were used as the detection indicators. Results After lewis tumor-bearing mice were treated with SMM flavonoids extract， focal or patchy necrosis of tumor cells and neovascularization were found in tumor infiltrating tissues; it also increased the levels of IL2 and IFN-γ in serum of tumor-bearing mice. Conclusion The flavonoid extract of Saussurea medusa has a certain anti-lung cancer immunotherapy effect.

腫瘤是嚴重威脅人類健康的一種疾病。其中肺癌的發病率逐年增高，也是致死率最高的癌癥之一。其主要治療方法包括手術、放療和化療等，但是該治療方案會導致患者免疫功能紊亂，預后差[1]。近幾年隨著人們對腫瘤治療的不斷研究和深入，發現在惡性腫瘤的綜合治療中，中醫藥可以通過調節機體的免疫機制來發揮抗腫瘤作用且毒副作用小[2]。因此本文采用lewis荷瘤小鼠為研究對象，初步探討藏藥水母雪蓮黃酮類的抗腫瘤作用，以期為腫瘤臨床治療及靶向藥物開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

SPF級野生型C57BL/6小鼠（6～8周齡、20～25 g）購于達科為生物公司，飼養于西藏民族大學實驗動物科學部。Lewis肺癌細胞株3LL由上海復旦大學贈予。水母雪蓮選擇西藏山南野生品種。CTX購自江蘇恒瑞制藥公司。多聚甲醛、二甲苯購于武漢科瑞生物技術有限公司。鼠IL-2（高敏）試劑盒、小鼠IFN-γ（高敏）試劑盒購自深圳欣博盛生物科技公司。

1.2植物樣本處理

100 g水母雪蓮中加入70%乙醇，于 60℃、50 min條件下提取2次，提取物凍干處理后得黃酮粗品。10% 胎牛血清DMEM培養基為溶劑，按實驗要求配制成水母雪蓮黃酮溶液5 g/L。

1.4 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型的建立與分組治療

將1×106個/mL的3LL單細胞懸液接種于小鼠腹股溝皮下，第5-7天， 能明顯觸摸到腫瘤結節（直徑約1 cm）則建模成功。建模成功后，隨機將接種小鼠分為生理鹽水組（NS）、SMM黃酮組、環磷酰胺陽性對照組（CTX），每組8只。每天早上同一時間陰性對照組給予生理鹽水灌胃20mL·kg-1·d-1;SMM組分別給予5 mg·ml-1灌胃，10mL·kg-1·d-1;CTX組隔天一次給予環磷酰胺腹腔注射50 mg·kg-1 CTX ，連續治療14 d。

1.5 HE染色

給藥結束的第二天，將已固定的腫瘤組織常規脫水、包埋和切片后HE染色，光鏡下進行組織形態學觀察。病理學形態觀察交由成都里來生物科技有限公司檢測。

1.6 ELISA檢測IL-2、IFN-γ的表達

給藥結束的第二天，各組荷瘤小鼠脫頸椎前摘眼球取血，離心分離血清。按照IL-2和IFN-γ試劑盒說明書操作，將酶標儀設置490 nm檢測各孔吸光度（A）值并計算IL-2和IFN-γ水平。

1.7 統計學處理

采用Graphpad Prism軟件處理數據，正態分布的計量資料以x±s 表示，組間比較One-ANOVA分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMM黃酮類對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤浸潤組織HE染色的影響

腫瘤組織HE染色觀察可見，NS對照組瘤細胞生長旺盛，細胞異形性較大。CTX陽性組腫瘤細胞出現局灶性或者片狀壞死，細胞核固縮。與NS組和CTX組相比，SMM組腫瘤細胞大小基本一致，細胞多呈圓形，腫瘤細胞出現局灶性或者片狀壞死，少量的淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，腫瘤間可見少量的腫瘤細胞壞死形成的空泡和少量的新生血管形成。（如圖1）。

2.2 SMM黃酮類可顯著提高Lewis荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ含量

與NS組比較（圖2），SMM黃酮組荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量極顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與CTX組相比，SMM黃酮組IL-2和IFN-γ含量均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

水母雪蓮又稱水母雪兔子，屬菊科風毛菊屬，是青藏高原分布較廣，產量較大的雪蓮花藥材，經證實水母雪蓮的乙醇、甲醇和水提物以及純化出的多糖、單體黃酮類化合物均有著明顯的抗腫瘤、抗風濕、鎮痛、強心、抗菌消炎和抗氧化等藥理活性[3]。研究表明水母雪蓮提取物對腹水型肝癌、S180癌細胞具有直接的殺傷作用[4]。但其是否可以通過調節患者免疫功能從而達到抗腫瘤效應的研究相對較少。

本研究以SMM黃酮類提取物為對象，探討了SMM的抗腫瘤作用。結果發現SMM黃酮類提取物不僅能夠促進腫瘤浸潤組織的腫瘤細胞壞死，還能幫助腫瘤間形成空泡并伴有新生血管形成。此外，本研究發現經SMM黃酮類提取物處理的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中的IL2、IFN-γ含量顯著增加。眾所周知，細胞因子是抗腫瘤免疫效應的重要評估指標[5]，其中IFN-γ主要由活化的CTL細胞、輔助T細胞、NK細胞等產生，可通過促進MHC-II類分子的表達從而增強APC細胞的抗原呈遞能力;還可通過促進MHC-I類分子表達以增強CTL細胞的殺傷活性，此外還可輔助刺激IL-2、TNF等細胞因子的產生[6]。提示SMM黃酮類提取物可以顯著上調腫瘤環境下正調控細胞因子的分泌以達到抗腫瘤免疫效應。

綜上所述，SMM黃酮類提取物能夠改善和恢復機體免疫功能，間接達到抗腫瘤的作用。促進正向細胞因子的分泌，從而抑制殺死腫瘤并促進腫瘤局部新生血管的形成。值得今后進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 崔益雯，王杰，陳騰.中藥調節腫瘤免疫應答的研究進展[J].腫瘤，2019，39（08）：674-679.

[2] 宋磊， 張嵐， 唐敏， 等. 中醫藥在惡性腫瘤整合醫學療法中的運用[J].中醫學報， 2018， 33（5）：23-26.

[3] 達娃卓瑪.西藏產雪蓮花的化學和藥理研究進展[J].中國民族民間醫藥，2015，24（12）：25-31.

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[5] Conlon KC， Miljkovic MD， Waldmann TA. Cytokines in the Treatment of Cancer[J]. J Interferon Cytokine Res. 2019 Jan;39（1）：6-21.

[6] Schoenborn JR， Wilson CB. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses[J]. Adv Immunol. 2007;96：41-101.

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81860719）;西藏自治區自然科學基金資助項目（XZ2017ZRG-59，XZ2018ZRG-72）;西藏民族大學新冠肺炎疫情應急項目（XZMDYJ04）;西藏自治區科技廳自然基金（2021年）。

作者簡介：張燕麗（1988-），女，碩士，講師，主要從事藏藥抗腫瘤免疫研究

通訊作者：張敏（1971-），女，博士，教授，主要從事抗腫瘤免疫研究

（西藏民族大學醫學部 自治區生命科學基礎實驗室 陜西 咸陽 712082）