呼吸道病毒實驗室檢測技術

魯健康

呼吸道感染是臨床上最多見的一種癥狀，也是引起疾病和死亡的重要因素。可引發呼吸道感染的病原菌有很多種，比如細菌、病毒、衣原體和支原體等，特別是病毒感染更多見。無論是哪種病原菌引起的感染，呼吸道感染的臨床表現都比較相似，但治療方法卻截然不同，所以，需要快速準確檢測出到底是感染了哪種病原菌，然后對癥治療，才能獲得有效的治療效果。在分子生物技術快速發展的今天，呼吸道病毒的檢測方法也不僅僅只依靠分離培養和免疫學技術，基因芯片和下一代測序技術等都獲得了廣泛應用，而且檢測效果更快、更靈敏，同時還具有特異性和高通量等，可滿足疾病治療的需求，下面我們一起了解下呼吸道病毒實驗室檢測技術。

1 、病毒分離培養

病毒分離培養法是呼吸道病毒檢測方法中最經典的一種，也是診斷的金標準。傳統的方法是將鼻咽的分泌物接種在敏感細胞，使用含2%小牛血清作為培養基，然后觀察細胞狀態，全過程需要大概7-15天左右，時間比較長，不利于疾病的早期診斷與治療，而且有些病毒的陽性檢出率比較低。20世紀90年代時，使用了載玻片培養，先采用低溫離心然后再進行培養，隔天再使用單克隆抗體染色，可清楚查看到感染的細胞。該方法對病毒分離培養的時間需要1-2天，縮短的檢測時間，為病人的治療爭取了更多有效時間。

2 、免疫學技術

直接免疫熒光技術指的是使用標有熒光素的抗病毒抗體和組織中的病毒抗原直接發生反應。該方法操作起來非常簡單，時間也比較短，還具有較高的特異性和敏感性，更有利于實驗室工作的進行，是常用的呼吸道病毒檢測方法。但該方法需要使用鼻咽深部的分泌物，會使病人更加痛苦。

間接免疫熒光技術指的是首先選擇相應病毒抗原與特異性抗體相結合，形成一種新的抗原抗體復合物，然后將該復合物與熒光標記的二抗進行反應，通過熒光顯微鏡去觀察。該方法可以同時對多種病毒進行檢查，但敏感性比較低，也會受到很多因素的影響。

酶聯免疫吸附試驗指的是利用抗原抗體的特異性與具有高效催化作用的酶相結合，檢測出呼吸道病毒抗原，還能檢測出相應病毒的抗體，該方法具有較高的敏感性，較強的特異性，而且也不存在放射性污染，所以是應用范圍較廣的實驗室呼吸道病毒檢測方法。

3 、芯片技術

芯片技術是對基因組學和蛋白質組學進行研究的一項有力工具。芯片技術與宏基因組學方法可快速鑒別診斷出病毒。該方法能夠幫助發現新的病毒，就算病毒沒有基因恒定區，也可通過測序獲得檢測結果，測序與微陣列芯片相結合也是一種非常強大的高通量診斷方法。

液相芯片技術是由很多大小一樣的圓形微球構成，每個微球上都裝有相應的熒光標記的分子探針，然后通過熒光信號去測定呼吸道病毒，該方法屬于一種新型生物技術平臺。

4 、下一代測序技術

從21世紀初，下一代測序就徹底改變了基因組學的領域，使得以前很多無法進行的實驗都得到廣泛開展。下一代測序具有多樣本、多功能和高通量的特點提高了呼吸道病毒檢測效果。

下一代測序技術發現了很多新病毒，很多病毒和菌株都是通過該方法鑒別檢查出的，比如2013年發現的副流感病毒。下一代測序具有的高敏感性實在令人難以置信，該方法能同時檢查多個病人的樣本，準確檢測出特定病原和病毒抗體，然后進行適當的治療。與Sanger測序比較來說，下一代測序從單個堿基來講存在一定的價格優勢，但如果只從單個反應而講，價格還是比較貴的，而且多數臨床實驗室對于該技術的認知不足，需求也不大。而且該技術從樣本準備到完善數據需要兩三天的時間，每個反應都會產生大量數據，需要具備豐富經驗的具有專業生物信息技術的人員分析。雖然面臨很多問題，但相信都會不斷完善，最后下一代測序會在呼吸道病毒實驗室檢測中獲得重要地位，發揮重要作用。

5 、納米技術

納米技術的出現也為科學發展開啟了新的方向。當物質發生變化縮小到納米級別時，就需要使用納米技術進行檢測，發揮它特有的功能。免疫聚合酶鏈反應是酶聯免疫吸附試驗與聚合酶鏈反應的結合，常用于多種病毒和細菌的檢測。有研究人員使用金標的納米顆粒改進免疫聚合酶鏈反應檢測出呼吸道合胞病毒，檢出率能達4.1pfu/ml，該方法的檢測敏感性要比聚合酶鏈反應的敏感性高出4000倍之多。

若想建立起該種檢查體系對呼吸道病毒進行檢測，還是比較難的，特別是病毒感染的初期階段。但由于分子標記技術的出現，活細胞追蹤成為可能，所以成功檢測出呼吸道合胞病毒。

總之，呼吸道病毒是造成呼吸道感染的重要因素，在眾多抗病毒藥物的廣泛使用，很多病毒對于常用藥物都會產生耐藥性，而且還有新的病毒在不斷威脅大家的健康，所以需要一種快速、靈敏且具有特異性的檢測方法來控制疾病的爆發，也避免亂用藥物。傳統的常用的病毒檢測方法是病毒分離培養法，雖然具有檢測的金標準，但用時比較長，很難應用于臨床治療。免疫熒光法，可在幾個小時內完成檢測，是目前臨床常用的病毒檢測方法。此外，還有芯片技術、下一代測序技術、納米技術以及質譜分析技術等。目前，分子檢測技術具有高靈敏度、用時短和高特異性等特點日益成熟。

（西昌市疾病預防控制中心 四川 西昌 615000）