人參低聚肽對急性酒精中毒大鼠的作用研究

劉睿 任金威 陳啟賀 李迪 毛瑞雪 劉欣然 烏蘭 杜倩 李勇

摘 要：目的：評價人參低聚肽（ginseng oligopetides，GOPs）對急性酒精中毒大鼠的作用效果。方法：根據體重將大鼠隨機分為酒精模型組、乳清蛋白組（250 mg/kg·BW）和4個GOPs劑量組（62.5、125、250、500 mg/kg·BW），另設1個正常對照組，每組10只。GOPs灌胃30 d后，以4 g/kg·BW濃度灌胃染毒造成大鼠急性酒精中毒模型（翻正反射實驗為7 g/kg·BW），進行行為學實驗（包括翻正反射、轉棒和網上攀附實驗）、檢測血乙醇濃度，并檢測大鼠肝臟乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）的活性。結果：GOPs干預能明顯減少急性酒精中毒大鼠的翻正反射消失比率，延長網上攀附時間，增加醉酒大鼠在轉棒上的停留時間，降低血乙醇濃度及提高肝臟ADH、ALDH活性。結論：GOPs可以通過加速酒精在體內的代謝，加強肝臟乙醇代謝酶活性，改善酒精引起的行為異常，從而對急性酒精中毒大鼠具有保護作用。

關鍵詞：人參低聚肽;急性酒精中毒;翻正反射;酒精代謝酶

急性酒精中毒在日常生活中極為常見，尤其是在年輕人群中，醉酒造成了很多社會負面效應和健康問題[1-3]，因此探討如何有效預防急性酒精中毒和保護機體免受急性酒精中毒的傷害已成為當務之急。2012年9月中國批準人參為新資源[4]。人參低聚肽（GOPs）是從人參中利用生物酶解技術分離得到的小分子生物活性肽類混合物，具有吸收快、水溶性高及粘度低等特點[5]。伴隨著生物化學和分子生物學技術的飛速發展，有關低聚肽的研究正逐漸引起人們的重視。現代研究發現，低聚肽比單個氨基酸的吸收更有效，并能直接參與蛋白質的合成，有效提高了蛋白質的吸收利用率[6]。GOPs是安全性高且具有多種生理活性的功能性肽類物質，目前研究已證實，GOPs具有免疫調節、改善血脂異常、抗疲勞、耐缺氧、抗輻射、抗炎等多種生理作用[7-11]。本研究通過采用不同劑量的GOPs水溶液對大鼠進行為期30 d的灌胃干預，以多種行為學實驗及血乙醇濃度變化為依據，評價GOPs對急性酒精中毒大鼠的作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

GOPs：為淡黃色固體粉末，主要以小分子寡肽為主，分子量小于1 000 Da的占97.39%，游離氨基酸含量為3.94 g/100 g，其中精氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸含量較多，購自吉林肽谷生物工程有限責任公司。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇（分析純）、叔丁醇（分析純），國藥集團化學試劑北京有限公司;乳清蛋白，北京中柏公司（其蛋白含量為78%）;乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）檢測試劑盒，北京麥格泰克科技有限公司;DXP-2大小鼠轉棒儀，中國醫學科學院藥物研究所;低溫高速離心機，德國Eppendorf公司;AdventurerTM通用型分析天平，美國OHAUS公司;數顯電熱恒溫水浴箱，上海躍進醫療器械廠;352型酶標儀（芬蘭，Labsystems Multiskan MS）;島津 GC-2010 氣相色譜儀。

1.3 實驗動物及分組

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠[體重（200±20）g]262只，由北京大學醫學部實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0010;實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2016-0041）。動物飼養在北京大學醫學部實驗動物科學部，動物實驗環境設施（屏障環境）合格證書：醫動字第 01-2055。飼養環境為屏障環境，溫度為（22±2）℃，相對濕度為50%～60%，晝夜循環時間為12 h。動物實行分籠飼養，每籠3只，自由飲水、進食。

適應性喂養5 d后，根據體重將大鼠隨機分為四大組，即翻正實驗組、網上攀附實驗組、轉棒實驗組和血乙醇濃度檢測組;每個實驗組再分為6個干預劑量亞組：即酒精模型組、乳清蛋白組（250 mg/kg·BW），GOPs低、中、高劑量組（62.5、125、250、500 mg/kg·BW），每個干預亞組10只大鼠（考慮到大劑量酒精容易造成大鼠死亡，翻正實驗每組12只）。另設1個正常對照組（10只）。每日經口灌胃干預，正常對照組和酒精模型組給予蒸餾水，乳清蛋白組和GOPs劑量組給予相應濃度受試物（均用蒸餾水配制）。動物每周稱重2次，根據體重及時調整灌胃量，干預時間為30 d。

1.4 方法

1.4.1 酒精灌胃造模 干預30 d結束后，各組動物禁食不禁水6 h后，分別用生理鹽水（正常對照組和酒精模型組）、乳清蛋白水溶液、GOPs水溶液灌胃，30 min后，給予50%（v/v）酒精4 g/kg·BW（翻正實驗劑量為7 g/kg·BW）灌胃造模，正常對照組給予等體積生理鹽水（17.5 mL/kg·BW）。酒精灌胃30 min后，進行行為學實驗（翻正反射、轉棒和網上攀附實驗）及乙醇濃度測定[12-13]。

1.4.2 翻正反射實驗 50%（v/v）酒精灌胃后，將大鼠以背向下的姿勢放于動物籠內，若大鼠在30 s內不能自主翻轉過來，可認為其翻正反射消失（即為醉酒）;當大鼠可以自己翻轉過來時，可認為其翻正反射恢復（即為醒酒），記錄每組翻正反射消失的只數和死亡大鼠數。翻正反射實驗結束后（超過16 h未醒者按16 h記錄），和正常對照組一起乙醚麻醉，快速分離肝組織，進行ADH、ALDH活性的檢測。

1.4.3 網上攀附實驗 酒精灌胃染毒30 min后，將大鼠輕輕放在距地面15 cm的垂直金屬網上。記錄大鼠在網上攀附的時間，網上攀附時間超過30 min者記為30 min，直接從網上掉落者記為0。

1.4.4 轉棒實驗 大鼠醉酒后的平衡協調能力主要用轉棒實驗來評價。轉棒儀的轉速設為12 r/min，酒精灌胃染毒30 min后，將大鼠放在轉棒儀上，使大鼠向轉動棒的相反方向運動，從大鼠抓住轉棒為起始點開始計時到大鼠從轉棒上掉落為止。每只大鼠觀察3次，以其中最長的一次作為該大鼠在轉棒上的停留時間，30 min為觀察終點。

1.4.5 血乙醇濃度的檢測 在酒精灌胃后30、60、90、120、180 min時行內眥靜脈采血，快速吸取0.2 mL移至頂空瓶內，并加入0.2 mL內標（叔丁醇溶液0.6 mg/mL）后，密封，采用頂真空氣相色譜法測定醉酒大鼠不同時間點的血乙醇濃度。氣相色譜儀條件：進樣口：200 ℃;檢測器：FID 220 ℃;載氣：氮氣（99.999%）;流速：10 mL/min;色譜柱：DB-WAX（30 mX 0.53 mm）;色譜條件：50 ℃起始保持2 min，10 ℃/min升溫至60 ℃，20 ℃/min升溫至100 ℃，40 ℃/min升溫至200 ℃保持2 min。

1.4.6 肝組織ADH、ALDH含量的測定 在翻正實驗結束后，乙醚麻醉處死大鼠，分離肝臟組織。取肝臟左外葉下段組織1 g 置于小燒杯中，加入6 mL 1×磷酸鹽緩沖液（PBS），冰浴中手動勻漿5 min，制成10%（w/v）的組織勻漿液，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，取上清，根據ELISA試劑盒說明書檢測樣本中ADH、ALDH含量。

1.5 統計方法

用SPSS 24.0對數據進行分析。連續變量數據用均數±標準差（±s）表示，行單因素方差分析并采用LSD法進行組間的統計檢驗;非正態分布數據采用Kruskal-Wallis檢驗進行分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 實驗動物一般情況

在30 d的實驗周期內，各實驗組大鼠外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量等均未見異常，無中毒體征及死亡。酒精灌胃后大鼠出現了明顯的醉酒癥狀，在酒精模型組4 g/kg·BW劑量染毒的大鼠多表現為興奮、共濟失調、極度活躍、狂躁等，7 g/kg·BW劑量染毒的大鼠大多陷入昏睡期，反應遲鈍，活動減少。GOPs各組大鼠精神狀態及行為異常情況均好于酒精模型組和乳清蛋白組，隨著干預劑量的增高表現情況越為好轉，且大鼠的精神狀況要好于乳清蛋白組。

2.2 GOPs對大鼠翻正反射的影響

如表1所示，干預30 d后，各組體重未觀察到明顯差異（P>0.05）。酒精模型組大鼠翻正反射消失比率達到了80%，且有2只實驗動物死亡。與酒精模型組相比，GOPs各組隨著干預劑量的增高大鼠翻正反射消失只數呈現出減少的趨勢，其中GOPs（500 mg/kg·BW）組翻正反射消失的比率為16.67%，與酒精模型組相比差異具有顯著性（P<0.01）。

2.3 GOPs對大鼠轉棒停留時間的影響

如表2所示，各組間體重無顯著性差異（P>0.05）。與酒精模型組相比，GOPs（125 mg/kg·BW）、GOPs（250 mg/kg·BW）和GOPs（500 mg/kg·BW）3組均能顯著增加大鼠的轉棒停留時間（P<0.01），30 min內轉棒上未掉動物只數也多于酒精模型組。GOPs各組與乳清蛋白組相比無顯著性差異（P>0.05）。

2.4 GOPs對大鼠網上攀附時間的影響

如表3所示，各組大鼠體重無明顯差異（P>0.05）。各組大鼠網上攀附時間無統計學差異（P>0.05），但GOPs各組大鼠網上攀附平均時間長于酒精模型組和乳清蛋白組。

2.5 GOPs對大鼠血乙醇濃度的影響

如附圖所示，GOPs干預有降低血中乙醇濃度的趨勢。GOPs（250 mg/kg·BW）組在乙醇染毒90、120、180 min時，血乙醇濃度與酒精模型組相比明顯降低，具有統計學意義（P<0.05）。GOPs（125 mg/kg·BW）組在乙醇染毒60 min時，血乙醇濃度明顯低于乳清蛋白組（P<0.05）;120 min時，血乙醇濃度較酒精模型組明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）。

2.6 GOPs對肝組織ADH、ALDH活性的影響

如表4所示，與正常對照組相比，酒精模型組ADH含量明顯增高，ALDH含量降低（P<0.05）。與酒精模型組相比，GOPs（125 mg/kg·BW）、GOPs（250 mg/kg·BW）、GOPs（500 mg/kg·BW）等3組ADH含量顯著增高，GOPs（62.5 mg/kg·BW）、GOPs（125 mg/kg·BW）組ALDH含量明顯高于酒精模型組（P<0.01）;與乳清蛋白組相比，GOPs（250 mg/kg·BW）、GOPs（500 mg/kg·BW）組ADH含量明顯增高，GOPs（62.5 mg/kg·BW）、GOPs（125 mg/kg·BW）組ALDH含量顯著增加（P<0.01）。

3 討論

目前針對酒源性疾病的研究大多都是動物實驗，酒精灌胃是目前應用最為普遍的造模方法[14]，但現階段有關急性酒精中毒的報道中，酒精染毒劑量、時間、濃度等很多都不一致，增加了動物實驗結果重復和比較的難度。Zhang F等[12]用體積分數為50%的乙醇按4 g/kg·BW的劑量給SD雄性大鼠一次性灌胃染毒后，觀察到大鼠出現了明顯的醉酒行為，如興奮、蹣跚、共濟失調等，以7 g/kg·BW劑量灌胃染毒后，大鼠翻正反射消失，進入了昏睡期。Liang J等[3]給SD雌性大鼠50%（v/v）乙醇5 g/kg·BW灌胃染毒后可觀察到大鼠醉酒行為，7 g/kg·BW灌胃染毒后大鼠進入了昏睡期。綜合以往研究，在大多急性酒精中毒動物模型中，乙醇染毒濃度為（4～7）g/kg·BW時，可以觀察到動物出現醉酒行為，如興奮、蹣跚、共濟失調、昏睡等，濃度為7 g/kg·BW時，實驗動物大多進入昏睡期[3，12，15-16]。在預實驗階段發現，當以4 g/kg·BW劑量酒精灌胃時，可以較為明顯地觀察到SD雄性大鼠醉酒行為，行為學實驗結果較好;酒精灌胃劑量為7 g/kg·BW時，大鼠醉酒程度加深，大多陷入昏睡狀態。因此，本研究通過灌胃給予大鼠50%（v/v）的酒精4 g/kg·BW（翻正反射實驗為7 g/kg·BW）以造成大鼠急性酒精中毒模型，來探討GOPs對急性酒精中毒大鼠的保護作用。考慮到肽是由蛋白質水解而來，除設立蒸餾水對照組外，另設了乳清蛋白作為蛋白質對照組，乳清蛋白是一種營養價值較高的優質蛋白，含必需氨基酸種類齊全、數量充足且比例適當，具有抗氧化、抗病毒、免疫調節等多種生理功能[17]。

急性酒精中毒按醉酒程度可分為興奮期、共濟失調期和昏睡期。翻正反射消失表明，實驗動物進入了昏睡期，急性酒精中毒程度深，可將翻正反射消失時間即醉酒時間的長短作為評價藥物干預效果的首要指標;網上攀附實驗和轉棒實驗則可用于評價大鼠醉酒后動作協調、肌肉力量及平衡協調能力;血乙醇的濃度與急性酒精中毒大鼠的行為改變密切相關，檢測血乙醇濃度的變化可以用來評價GOPs對乙醇代謝的影響[3，12-13]。本研究結果顯示，GOPs能夠減少翻正反射消失比率，酒精模型組80%的大鼠陷入了昏睡期，GOPs各組隨劑量的增高陷入昏睡期的老鼠明顯減少，較酒精模型組明顯延遲了醉酒時間，在GOPs（0.500 0 g/kg·BW）組僅有2只陷入昏睡期，表明經30 d GOPs干預后能明顯減少SD雄性大鼠醉酒率。網上攀附實驗和轉棒實驗結果顯示，GOPs干預可以延長醉酒大鼠網上攀附時間和增加大鼠在轉棒上的停留時間。此外，GOPs干預還可以明顯降低血清乙醇含量，除GOPs（0.062 5 g/kg·BW）組外，GOPs其余三組在各時間點的血乙醇濃度均低于酒精模型組和乳清蛋白組，其中GOPs（0.250 0 g/kg·BW）組在各時間點血乙醇濃度均最低，乙醇染毒后90、120、180 min時，血乙醇濃度與酒精模型組相比差異具有顯著性（P<0.05）。以上結果表明，GOPs對急性酒精中毒具有明顯的預防作用，還可以降低血乙醇的含量。

機體攝入的酒精90%在肝臟代謝，先由肝細胞內的ADH氧化為乙醛，再經ALDH氧化為乙酸，乙酸進一步分解為水和二氧化碳排出體外[18-19]。肝組織酒精代謝酶ADH和ALDH活性的加強可有效地促進酒精在體內的代謝[20]。本研究結果發現，與正常對照組相比，酒精模型組ADH含量顯著升高（P<0.01），說明酒精攝入導致肝臟乙醇代謝酶活性增強，ALDH含量降低，表明ADH的高表達伴隨降低的ALDH表達，提示了乙醛在肝臟的聚集，這與Yun J W等[20]的研究結果類似，他們給雌性野生型（wild-type，WT）小鼠以6 g/kg·BW酒精灌胃染毒，連續3次，每次間隔12 h，檢測發現小鼠肝組織ADH顯著升高。在GOPs干預組，除GOPs（0.250 0 g/kg·BW）組的ALDH活性低于酒精模型組外，GOPs各組ADH和ALDH活性均高于酒精模型組，且ADH含量在GOPs（0.250 0 g/kg·BW）、GOPs（0.500 0 g/kg·BW）組及ALDH含量在GOPs（0.062 5 g/kg·BW）、GOPs（0.125 0 g/kg·BW）組均顯著高于酒精模型組和乳清蛋白組（P<0.01），表明GOPs干預提高了機體乙醇相關代謝酶的活性，促進了乙醇在體內的分解代謝，減輕了酒精及其代謝產物對機體的急性損害，對急性酒精中毒大鼠起到了保護作用。

綜上所述，本研究以健康雄性SD大鼠為研究對象，通過50%（v/v）酒精灌胃染毒，探討了GOPs對急性酒精中毒的影響，結果表明，GOPs干預能夠明顯減少大鼠翻正反射消失的比率，增加大鼠在轉棒上的停留時間，延長網上攀附時間，并降低血乙醇濃度，增加ADH、ALDH活性，促進乙醇的氧化代謝，表明GOPs具有一定的預防急性酒精中毒的作用，這對早期防治急性酒精中毒的發生及對機體的傷害有重要的意義。

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Effect of Ginseng Oligopeptides on Acute Alcoholism Rats

LIU Rui，REN Jin-wei，CHEN Qi-he，LI Di，MAO Rui-xue，LIU Xin-ran，WU Lan，DU Qian，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of ginseng oligopetides（GOPs）on acute alcoholism in rat.Method Based on the body weight，rats were randomly divided into alcohol model group，whey protein group（250 mg/kg·BW）and four GOPs intervention groups（62.5，125，250，500 mg/kg·BW），and plus a normal control group，ten animals in per group.After administration with GOPs for 30 days，4 g/kg·BW ethanol（7 g/kg·BW for loss of righting reflex test）was given by orally gavage.Ethanol levels in blood，behavioral studies including loss of righting reflex assay，rotarod test and climbing test，and alcohol dehydrogenase（ADH），acetaldehyde dehydrogenase（ALDH）activities in liver were assayed.Result GOPs intervention increased the time of climbing test and retarod test，reduced the rate of loss of righting reflex and alcohol level in serum，and increased ADH and ALDH activities in liver significantly.Conclusion GOPs treatment could promote the alcohol metabolism，enhance the activities of liver ethanol metabolizing enzymes and correct the movement disorder caused by alcohol consumption to some extent，thus having protective effect on acute alcoholism rats.

Keywords：ginseng oligopetides（GOPs）;acute alcoholism;loss of righting reflex assay;alcohol metabolizing enzyme

作者簡介：劉 睿（1991— ），女，博士研究生，研究方向：營養與疾病。

通信作者：李 勇（1958— ），男，博士，教授，研究方向：營養與疾病。