針藥療法對糖尿病大鼠腎功能的影響

薛娣

摘要：目的觀察針藥聯合療法對糖尿病大鼠腎臟功能的影響。方法：將SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、電針組、藥物組和針藥聯合組5組，每組10只。采用鏈脲佐菌素60μg/g腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，48h后葡萄糖氧化酶法測血糖，空腹血糖≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功。電針組給予足三里、內庭穴電針治療，1d1次;藥物組給補氣化瘀藥物（處方組成：黃芪12g，赤芍25g，當歸20g，紅花15g，川芎15g，地龍20g，桃仁15g）0.015mL/g灌胃，1d1次;針藥聯合組采用電針和補氣化瘀藥物相結合的聯合療法。蘇木蘇-伊紅、過碘酸-希夫染色腎組織，觀察其形態學變化;心臟取血，測空腹血糖（fastingbloodglu-cose，FBG）、血肌酐（serumcreatinine，SCr）、尿肌酐（urinecre-atinine，UCr）和內生肌酐清除率（creatinineclearance，Ccr）;一氧化氮（nitricoxide，NO）、內皮素（endothelin，ET）、一氮化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）水平;免疫組化染色測定腎組織轉化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）蛋白的表達和定位。結果：與模型對照組對比，電針組、藥物組和針藥聯合組大鼠FBG、SCr、Ccr、NO、NOS和TGF-β1水平明顯降低，UCr升高，NO與ET比值增高，差別均有統計學意義（P<0.05）。與藥物組和電針組對比，針藥聯合組大鼠FBG、SCr、Ccr、NO、NOS和TGF-β1水平降低，UCr升高，NO與ET比值增高，差別均有統計學意義（P<0.05）。結論：中醫針藥聯合能明顯改善糖尿病大鼠的腎臟功能，能抑制腎臟TGF-β1水平，對糖尿病大鼠早期腎臟損害有保護作用。

關鍵詞：針藥聯合;電針;補氣化瘀藥物;糖尿病/治療;腎功能;動物模型，大鼠

糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常見的一種并發癥，常引起腎功能衰竭，是患者致死的主要原因。中醫學認為糖尿病以陰虛為本、燥熱為標，治療多采用滋陰清熱、生津、滋腎等方法。近年來，針刺、艾灸等方法治療糖尿病取得了較好的療效。研究報道，針藥結合在糖尿病的治療及其并發癥的防治方面具有較好的效果。本研究采用針刺加補氣化瘀中藥的聯合方法治療糖尿病腎病大鼠，通過觀察大鼠空腹血糖（fastingblood-glucose，FBG）、血肌酐（serumcreati-nine，SCr）、尿肌酐（urinecreatinine，UCr）、內生肌酐清除率（creatinineclearance，Ccr）、一氧化氮（nitricoxide，NO）、一氮化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）、轉化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）等指標，研究其對糖尿病大鼠腎臟的保護作用機制。

1材料與方法

1.1動物

雄性SD大鼠，50只，清潔級，3月齡，體質量150～200g，購于鄭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK豫2010-0002。將大鼠喂養在室溫20～25℃的清潔級動物房內，普通飼料喂飼，自由飲水。

1.2藥品、試劑與儀器

補氣化瘀藥物處方組成：黃芪12g，赤芍25g，當歸20g，紅花15g，川芎15g，地龍20g，桃仁15g。藥材購自河南省醫藥藥材有限公司，水煎制劑濃縮至每毫升藥液含生藥1g，高壓滅菌后存放于4℃冰箱內備用。鏈脲佐菌素（STZ），Sigma公司產品，批號20120907;TGF-β1多克隆抗體，北京博奧森生物科技有限公司產品，批號20150219;血糖測定試劑盒，南京建成生物工程公司產品，批號20141209。血糖測試儀，南京建成生物工程公司產品;G6805-2A型低頻電針儀，上海華誼醫用儀器有限公司產品;PUZS-300全自動生化分析儀，北京普朗新技術有限公司產品。

1.3動物分組與模型的建立

喂養大鼠1周后，將其隨機分為正常對照組、模型對照組、電針組、藥物組和針藥聯合組5組，每組10只。禁食、不禁水12h后，除正常對照組外，其余4組均一次性腹腔注射STZ60μg/g建立糖尿病模型;正常對照組注射等體積檸檬酸緩沖液。48h后采用葡萄糖氧化酶法測血糖，血糖≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功。

1.4給藥方法

造模成功后第7天，正常對照組、模型對照組予生理鹽水0.015mL/g灌胃，1d1次;藥物組給予補氣化瘀藥物0.015mL/g灌胃，1d1次;電針組給予電針治療[5]（強度1mA，頻率160～180次/min），取穴足三里、內庭，每次30min，1d1次;針藥聯合組采用電針和補氣化瘀藥物相結合的聯合療法。各組均連續治療6周。

1.5檢測指標

1.5.1一般情況藥物干預結束后觀察大鼠的一般情況，包括體質量、毛色、精神狀態、飲食等。

1.5.2FBG、NO、UCr、SCr和CcrFBG測定：治療停止前1d尾靜脈采血，采用血糖測試儀測量FBG。NO、UCr測定：治療停止前1d收集24h尿液，用全自動生化分析儀檢測NO、UCr。SCr測定：治療停止24h后，以質量分數為50g/L的水合氯醛10μL/g腹腔注射麻醉，心臟取血，分離血清，-20℃保存備用。采用生化分析儀檢測SCr。Ccr測定：根據生化檢測數值計算Ccr數值。Ccr=尿肌酐濃度（mg/L）×尿量（L/24h）/血漿肌酐濃度（mg/L）

1.5.3腎臟肥大指數心臟取血后處死大鼠，取雙側腎臟，清洗干凈，用濾紙吸干腎表面血液，稱量質量并計算腎臟肥大指數，甲醛固定，備用。腎臟肥大指數=雙側腎質量總和（g）/體質量（kg）×100%

1.5.4腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達取甲醛固定24h的腎組織，流水沖洗，用體積分數為70，80，90，95，100mL/L的乙醇梯度依次脫水各30min，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片（厚度約為2μm），蘇木蘇-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、過碘酸-希夫（periodicacidschiff，PAS）染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。免疫組織化學法測定TGF-β1表達。

1.6統計學方法采用SPSS17.0統計分析軟件處理。數據以均數（x）±標準差（s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1各組大鼠一般情況對比

正常對照組大鼠精神狀態良好，毛發光澤，行動敏捷。模型對照組大鼠精神萎靡，毛發干枯、發黃，行動遲緩，多飲、多食、多尿、體質量減輕的“三多一少”癥狀明顯。藥物組、電針組及針藥聯合組大鼠的一般狀態均較模型對照組有不同程度的改善。

2.2各組大鼠FBG、SCr、UCr和Ccr對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠FBG、SCr、和Ccr均升高，UCr降低，差別有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組對比，藥物組、電針組和針藥聯合組大鼠FBG、SCr、和Ccr均降低，UCr升高，差別有統計學意義（P<0.05）。與藥物組和電針組分別對比，針藥聯合組大鼠FBG、SCr、Ccr均下降，UCr升高，差別有統計學意義（P<0.05）。

2.3各組大鼠腎臟肥大指數、NOS、NO和NO/ET對比

與正常對照組對比，模型對照組腎臟肥大指數、NOS水平和NO活性升高，NO/ET降低，差別有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組對比，藥物組、電針組和針藥聯合組大鼠腎臟肥大指數、NO水平和NOS活性均顯著降低，NO/ET明顯升高，差別有統計學意義（P<0.05）。與藥物組及電針組分別對比，針藥聯合組腎臟肥大指數、NOS水平和NO活性均降低，NO/ET升高，差別有統計學意義（P<0.05）。

2.4各組大鼠腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達對比光鏡下：正常對照組大鼠腎臟腎小球結構完整，腎小球毛細血管基底膜均勻，無增厚，未見腎小球肥大。模型對照組大鼠腎臟腎小球腫脹增大，腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜區增寬，腎小管腫脹明顯。藥物組和電針組大鼠腎臟有不同程度的病理改變，但較模型對照組輕，表現為腎小球輕度肥大，少量的系膜細胞和基質的增多，腎小管腫脹不明顯。與藥物組、電針組對比，針藥聯合組腎小球體積明顯減小，病理改變減輕。與正常對照組對比，模型對照組大鼠TGF-β1表達明顯增多，差別有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組對比，藥物組、電針組和針藥聯合組大鼠TGF-β1表達均降低，差別有統計學意義（P<0.05）。與藥物組及電針組分別對比，針藥聯合組大鼠TGF-β1表達下降，差別有統計學意義（P<0.05）。

3討論

糖尿病腎病屬中醫學“消渴”并發“水腫”范疇，是一種以腎小球肥大、腎小球濾過減少、腎纖維化和腎功能損害為特征的慢性病。根據治病求本、兼治其標的中醫治療原則，中醫藥在臨床癥狀改善率、降低SCr、改善腎功能等方面具有很大的優勢，中醫針法治療糖尿病也取得了較好的療效。本研究采用針藥聯合治療，發現其對糖尿病腎病大鼠有減輕腎臟損傷的保護作用。NO為內皮細胞舒血管因子，可降低血管張力，造成腎細胞損害，促進炎癥產生與發展。NOS為一氧化氮合成酶，可促進NO的合成。研究發現，糖尿病腎病患者腎臟表達高水平內皮型NOS，激活NO活性，引起腎小球高濾過狀態及系膜基質的增生。因此NO作為血管活性物質參與了腎小球高灌注、高濾過的發生、發展和腎細胞的損傷。本實驗中，模型對照組大鼠體質量下降，腎臟肥大指數、FBG、Ccr、SCr均顯著升高，UCr數值降低，提示糖尿病大鼠腎臟功能受損。同時模型對照組大鼠腎臟肥大指數、NO水平和NOS活性升高較明顯，NO/ET顯著降低，表明此模型可能處于DN早期。針藥聯合治療后，大鼠腎臟肥大指數顯著降低，NO水平、NOS活性也降低，NO/ET卻明顯升高，證實針藥聯合治療通過影響大鼠體內NO水平、NOS活性和NO/ET，使腎小球的高濾過降低，對早期DN腎臟起到保護作用。TGF-β是具有調節細胞生長、分化功能的活性多肽，機體內以TGF-β1含量最高。在腎臟中，TGF-β廣泛分布于腎小管、腎小球與腎間質中，TGF-β在DN的發生與發展中扮演著非常重要的角色。實驗結果顯示：在DN發生早期，TGF-β1及TGF-β1mRNA表達就明顯升高，血糖水平隨著TGF-β1水平升高而升高。細胞實驗也顯示TGF-β1具有誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的作用。RNA測序技術實驗結果證實TGF-β1介導了腎纖維化和DN的發生、發展進程。本實驗結果顯示：糖尿病模型組大鼠較正常對照組大鼠不僅血糖升高，而且Ccr升高、TGF-β1表達增多。提示糖尿病腎病的病理過程可能與這些因素的參與有關。針藥聯合組大鼠在6周的干預治療后，FBG、SCr、Ccr均明顯低于模型對照組，特別是TGF-β1表達顯著降低，說明了針藥聯合治療能夠降低腎臟TGF-β1表達而使血糖水平降低，從而改善DN大鼠的腎臟功能。綜上所述，中醫針藥聯合療法可有效改善DN大鼠的腎功能并降低血糖水平，有望在治療糖尿病及其并發癥方面發揮重要作用。

4參考文獻

[1]沈嵐，俞立強，熊佩華.六味地黃湯合黃連解毒湯對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護作用及相關機制[J].南京中醫藥大學學報，2013，29（6）：553-557.

[2]王衛娜.三七總皂苷對糖尿病大鼠腎臟相關炎癥因子的影響[J].中醫研究，2016，29（2）：73-74.

[3]鄧紅，王新，徐芳，等.六味地黃湯對糖尿病腎病大鼠腎功能及細胞凋亡的影響[J].中草藥，2010，41（10）：1679-1682.

[4]張海燕，鄔偉魁，李芳，等.針藥結合治療糖尿病及其并發癥研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）：260-264.

[5]]賈寧，李瑞，曹昺焱，等.電針“足三里”“腎俞”穴對T2DM大鼠GLUT2、GCK的影響[J].世界中醫藥，2017，12（5）：1114-1119.

[6]張文奎，李茜，宮翠紅，等.針刺聯合黃芪多糖對db/db小鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白表達的影響[J].上海針灸雜志，2016，35（6）：738-741.

[7]蔡紅蝶.丹參莖葉對慢性腎功能損傷的改善作用及機制研究[D].南京：南京中醫藥大學，2017.

[8]張海燕，鄔偉魁，李芳，等.針藥結合治療糖尿病及其并發癥研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）：260-264.

[9]孫志，李茜，宮翠紅.針藥結合對db/db小鼠血糖和胰島素抵抗的影響[J].中國老年學雜志，2012，32（19）：4195-4197.

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