高效液相色譜技術中常見問題分析及解決方法

張曉

摘要：高效液相色譜（HPLC）是以液體作為流動相，利用樣品各組分在流動相和固定相中分配系數或吸附系數的差異來實現不同組分分離的色譜分析技術。該技術具有實用、快速、靈敏、效率高等特點，在醫藥、環保、石化、生命科學、食品工業等領域有著廣泛的應用。高效液相色譜儀在使用過程中常會出現一些影響分析結果的問題，包括鬼峰、保留時間漂移、峰前延、峰拖尾、峰變寬、負峰以及無色譜峰出現等，本文結合筆者多年HPLC操作經驗，談談上述各種問題產生的原因及其相應的解決方法。

關鍵詞：高效液相色譜技術;常見問題;解決方法

1 常見問題及解決方法

1.1 鬼峰

在液相色譜的洗脫過程中有時會出現實際測試樣品中不存在的色譜峰，此類色譜峰稱之為鬼峰。鬼峰時有時無，不具備規律性，但它們對目標峰的準確判斷產生極大干擾。一般來說，鬼峰產生的原因可能有3個，即樣品前處理不當、流動相污染以及測試過程中的樣品殘留，分述如下。

1.1.1 樣品前處理不當

樣品前處理不當可能會產生鬼峰，一般源于兩個途徑：一是所用試劑被污染;二是測試容器不干凈。鑒別起來比較簡單：使用試劑稀釋樣品，如果待測樣品出峰明顯減小而鬼峰變化不大，則鬼峰源自試劑污染。如果潔凈容器后重新檢測鬼峰消失，則鬼峰源自容器的污染。

1.1.2 流動相污染

鬼峰的產生更多是由流動相污染所致，包括水相、有機相以及添加劑的污染。水相長時間放置或是多次使用沒有更換，易滋生細菌等微生物而污染，甚至會溶解空氣中懸浮的顆粒和有機物，引入新的污染物。有機相和添加劑如果純度不夠含有雜質，每次補充流動相時以直接補給的方式，沒有對貯液瓶進行清洗更換，富集的污染物就會進入到儀器流路中產生鬼峰。

1.1.3 測試樣品的殘留影響

測試樣品的殘留也會產生鬼峰。殘留物通常來源于三個方面：進樣口端污染、測試樣品濃度過載殘留以及色譜柱和儀器管路中污染物的富集。

在不改變測試條件情況下，如果鬼峰每次有規律地出現在色譜圖的相同位置，則污染很可能來自于自動進樣器端。這時可將自動進樣針和針座拆下，分別用甲醇、丙酮和環己烷進行超聲清洗。

1.2 保留時間漂移

保留時間是HPLC分析的重要依據。同一種物質在相同色譜條件下，如果前后兩次的保留時間之差超過30s，就可認為保留時間發生了漂移，此時就無法對該物質進行準確的定性定量分析。導致保留時間漂移的因素包括流動相混入空氣、系統壓力不穩定、色譜柱的性質變化以及環境溫度不穩定等。

1.2.1 流動相混入空氣

儀器流路中連續混入氣泡，樣品的保留時間會發生無規律的變化。混入氣泡的原因可能有2個，一是在線脫氣機脫氣不完全，流動相中仍存有大量的空氣。這種情況可預先將流動相進行超聲脫氣處理，然后再裝入儲液瓶中待用。二是由于水相和有機相的物理化學性質存在差異，兩者在相互混合時，增加了空氣在兩種流動相中的溶解度。對于這種情況的等度洗脫實驗，可提前將流動相按所需比例配置好，然后超聲脫氣待用。

1.2.2 系統壓力不穩定

系統壓力不穩定直接影響了物質的出峰時間。其中，樣品與流動相相容性差、流動相混合器故障、單向閥故障、泵密封墊損壞、儀器管路接口松動及損壞是造成系統壓力不穩定的常見因素。

在選擇待測組分的溶劑時首先要考慮流動相與樣品的相溶性，如沒有特殊原因，一般選擇流動相作為待測組分的溶劑，以降低由于待測樣品在流動相中溶解性差引入的空氣量。

液相色譜儀采用動態混合器和靜態混合器將不同通道出來的流動相混合均勻。一旦混合器發生故障，待測樣品的洗脫效果不一，系統就無法達到平衡，導致壓力不穩基線不平。此時應立即停止實驗，查明原因，確認是否需要更換部件。

單向閥工作時液體呈單向流動，如果長時間使用緩沖鹽作為流動相，少量沒被洗脫的緩沖鹽結晶會阻塞單向閥的閥門，降低閥的流通性，導致流路流速改變，甚至還會發生單向閥漏液，進而造成系統壓力不穩。遇到這種情況，處理辦法是取出入口和出口單向閥的閥芯，依次在水、甲醇中超聲清洗15min以上。如果單向閥的白色濾頭顏色加深變黑，就要直接更換。假如以上方法還不能解決問題，則要檢查密封墊圈或者單向閥有否磨損，一旦磨損要及時更換。

1.3 峰變寬

峰變寬會導致相近的兩個色譜峰相互重疊，僅以一個峰出現在譜圖中，不利于樣品的分離檢測。出現此類情況，可采取以下措施：（1）改變流速。適當加大流速，可明顯改善由流速過低引起的峰變寬現象。（2）重新進樣。系統未達到平衡就開始做測試，峰形會發生無規則的變化，可待系統平衡穩定后重新進樣。（3）更換柱子。移除色譜柱前端的保護柱，根據峰形變化來判斷是保護柱還是色譜柱受到污染。如峰形有明顯改善，則需更換保護柱的濾芯。反之，則需清洗或更換色譜柱。（4）調節流動相的比例或者重新選用合適的流動相。

1.4 負峰

負峰在液相色譜圖中出現十分頻繁，分為以下兩種情況：所有峰均為負峰和出現個別負峰。

當色譜圖上所有的峰都為負峰時，十之八九是儀器的線路出了問題。這時應檢查連接線路，看數據處理系統信號的線是否接反，或記錄儀、檢測信號極性接反。

液相色譜圖中出現一個或多個負峰，原因可能有3個：（1）樣品中的溶劑與流動相不一致。如果溶劑的紫外吸收弱于流動相，就會減弱色譜圖中某一位移處的信號，溶劑峰呈負峰形式。解決方法是使用流動相作為樣品的溶劑。（2）樣品前處理中混入了其他雜質。假如雜質的紫外吸收弱于溶劑和流動相，當一定濃度的該類物質流出時，就可能出現負峰。但如果負峰不影響待測組分出峰，就不必對樣品作進一步純化處理。（3）流路中存在氣泡。當流路中殘留的氣泡經過流通池時，色譜圖上某一位移處的紫外吸收特別弱，就會出現負峰。碰到這種情況，只有將流路中的氣泡排盡才能消除負峰對測試的影響。

2 結語：

高效液相色譜儀是一種操作要求嚴、技術含量高、實踐領會強的大型精密分析儀器，我們只有加強日常維護，在使用中認真應對，及時發現異常，找出原因并予以解決，才能延長儀器的使用壽命，保證檢測的準確性，讓儀器的功能和特點得到最大限度的發揮和利用。