果王素對小鼠肺腺癌移植瘤NPM表達的調控及意義

鐘柏英 陳薈婷 賀立洋 魏文婕 賀兼斌

摘要：目的 觀察果王素對小鼠肺腺癌移植瘤生長和轉移的抑制作用，檢測小鼠移植瘤腫瘤組織中NPM的表達，探討果王素抑制腫瘤生長與轉移可能的機制。方法 構建肺腺癌小鼠移植瘤模型，將32只接種Lewis肺腺癌細胞的C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、低劑量（60mg/kg）果王素組、中劑量（120mg/kg）果王素組和高劑量（240mg/kg）果王素組，每組8只。接種后第4天起，予以相應藥物干預，第24天處死小鼠，分離移植瘤稱瘤體質量，計算轉移抑制率與腫瘤抑制率，剖胸取肺組織觀察腫瘤轉移情況，免疫組化法檢測小鼠皮下移植腫瘤細胞中NPM的表達水平。結果 果王素組小鼠皮下移植瘤的生長速度、體積、質量和肺轉移結節數較對照組明顯降低，而腫瘤抑制率和肺轉移抑制率顯著升高，皮下移植瘤中NPM蛋白表達水平下降。而且果王素的濃度越高，上述指標差異越明顯，差異有統計學意義。結論 果王素對小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉移有明顯的抑制作用，其作用機制可能是通過抑制NPM過表達，抑制腫瘤的生長與轉移。

關鍵詞： 果王素 小鼠 NPM 肺腺癌 轉移瘤

【中圖分類號】R734.2 ?【文獻標識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）09-013-02

肺癌是目前世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是我國死亡率上升最快的癌癥， [1-2]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，非小細胞肺癌占80%-85%，肺腺癌最常見的非小細胞肺癌，大部分患者確診時已為中晚期，喪失手術治療機會[3]，放化療為該類患者的標準治療方案，但近年來其療效已達到瓶頸，且副作用嚴重 [4]。因此尋找高效、低毒的天然藥物抑制腫瘤的生長和轉移是今后抗腫瘤的新策略之一。果王素（獼猴桃果仁油脂肪酸）具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[5]。課題組前期研究表明[6-7]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生長和轉移。但其具體的抗腫瘤機制尚不太明確。NPM（核仁磷酸蛋白）是一種核仁蛋白，在細胞增殖和生長中發揮重要作用[8-9]。有研究表明[10-13]，NPM在多種腫瘤組織中過表達，其表達水平與腫瘤發展階段呈正相關。本研究通過構建肺腺癌小鼠移植瘤模型，予以不同劑量的果王素進行干預，觀察其對肺腺癌小鼠移植瘤生長和轉移的作用，并檢測腫瘤組織中NPM蛋白表達水平，探索其抗腫瘤的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ?實驗動物 ?Lewis肺腺癌荷瘤種鼠（鼠源）2只，購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。C57BL/6J 小鼠32只，雄性，體重（20±2）g，購于中國醫學科學院腫瘤醫院實驗動物中心，（許可證號：SYXK[京]2019-0019）。

1.1.2 藥品及試劑 果王素購于湘西老爹生物有限公司，為黃色油性液體，中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸含量為600 g/L。兔抗鼠Nucleophosmin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒、DAB顯色劑由福建邁新生物技術開發公司提供。

1.2 ?動物模型的建立 ?處死Lewis 肺腺癌荷瘤種鼠，無菌條件下剝離腫瘤并去掉表面結締組織、血管以及內部壞死組織，按1 g腫瘤組織加4ml 0.9% 氯化鈉溶液的比例在表面皿中剪碎，置入勻漿機中研磨成勻漿液，用孔徑 0.042 mm的360 目鋼網濾過，制成腫瘤細胞懸液，倒入離心管，加入0.9% 氯化鈉溶液，顯微鏡下將細胞密度調節為 2×106 個 /mL，在每只C57BL/6J 小鼠右后腿根部外側皮下注射 0.2 mL 的腫瘤細胞懸液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.3實驗分組及用藥 ?所有小鼠接種腫瘤細胞后第4天，皮下移植處均見小結節樣腫瘤生長，開始予以藥物干預。按隨機數字表法將32只小鼠分為4組，每組8只，對照組、低劑量（60mg/kg）果王素處理組、中劑量（120mg/kg）果王素處理組和高劑量（240mg/kg）果王素處理組，劑量依據課題組前期工作及相關文獻而定[6-7]。對照組小鼠給0.9% 氯化鈉溶液0.3 mL灌胃，果王素處理組小鼠分別以0.3ml用0.9% 氯化鈉溶液稀釋（60、120、240）mg/kg果王素的液體灌胃，每天一次。腫瘤接種后第24天處死全部小鼠，取出皮下移植瘤，固定于4%中性甲醛溶液，后包埋于石蠟，以供免疫組織化學染色檢測。剖胸取雙肺組織置入Boins液固定，用以觀察肺表面轉移結節數。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 腫瘤生長與轉移的觀測 ? 小鼠接種腫瘤細胞第4天起，每3天測量皮下移植瘤最大長徑a和短徑b一次，計算腫瘤體，腫瘤平均體積=0.52a×b2。實驗結束后，分離移植瘤，稱腫瘤重量，計算腫瘤抑制率（%）=（1-果王素處理組瘤體質量/對照組瘤體質量）×100%。剖胸取雙肺組織，置入Boins液處理后，對肺表面的轉移結節進行拍照并計數，計算肺轉移抑制率（%）=（1-果王素處理組平均轉移結節數/對照組平均轉移結節數）×100%。

1.4.2 免疫組織化學法檢測 ? 用免疫組織化學S-P法檢測NPM的表達，方法及步驟嚴格按試劑盒說明書進行，一抗為兔抗鼠Nucleophosmin單克隆抗體，抗體按1：100稀釋，用PBS緩沖液替代一抗為陰性對照。NPM染色結果判定標準：細胞核中出現清晰棕黃色或棕褐色顆粒清晰為陽性。采用全自動圖像分析系統測定腫瘤組織中NPM的平均灰度值。

1.5 統計學分析 ? 應用SPSS 20.0軟件對所有實驗數據進行統計學處理，定量數據以 表示，采用X2檢驗、單因素方差分析、q檢驗分別比較率、多組間均數、兩兩間均數，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1果王素抑制小鼠移植瘤的生長和轉移

接種腫瘤細胞后，皮下移植處成瘤率100.0%，接種后的前4天，各組小鼠皮下移植瘤大小無明顯差異，后逐漸增大，局部呈結節狀，接種第18～24天后，各劑量果王素處理組小鼠皮下移植瘤生長明顯慢于對照組，且高劑量果王素組腫瘤生長最，接種腫瘤細胞后第24天，各組小鼠均存活。處死小鼠后解剖觀察見各劑量果王素處理組對皮下移植瘤生長及腫瘤肺轉移均有明顯抑制作用（圖 1、2）。與對照組相比，各劑量果王素處理組皮下腫瘤的體積、質量和肺表面轉移結節數均明顯降低（P<0.05， P<0.01），而腫瘤抑制率和肺表面結節轉移抑制率均明顯升高（P<0.05， P<0.01），與低果王素處理組比較，中高果王素處理組上述指標顯著改善（P<0.05， P<0.01），而且，高果王素處理組上述指標較中果王素處理組改善更明顯（P<0.05），表 1。

2.2果王素下調小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表達

NPM蛋白表達與腫瘤細胞胞核中，出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。對照組出現較多NPM陽性細胞，低、中、高劑量果王素處理組均仍有少量陽性細胞，而且隨著果王素劑量升高，NPM表達依次減少，各組之間相比差異均有統計學意義（P<0.01，圖3）。

3、討論

肺癌惡性程度高，易出現遠處轉移，預后較差。肺癌的發生發展受多因素影響，與多種癌基因過度表達及抑癌基因的失活密切相關。近年來，靶向治療開創了肺癌治療新時代。果王素為獼猴桃果仁靜臨界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分為a-亞麻酸，含有一定量的維生索E及微量元素硒等物質，具有抗癌和保護正常組織細胞活性的作用。課題組前期研究表明[6-7，14]，果王素度肺腺癌的生長與轉移有較好的抑制作用。本研究發現，與對照組相比，各劑量果王素組小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生長速度、質量和肺轉移結節數明顯降低，而腫瘤抑制率和肺轉移抑制率則明顯升高，并且隨著果王素處理劑量的效果越顯著，各組間相比均有統計學意義。結果表明果王素能明顯抑制肺腺癌移植瘤的生長與轉移，且呈劑量依賴性。

另外，本研究通過檢查小鼠肺腺癌移植瘤內NPM的表達情況，為了進一步探討果王素是否通過調控NPM表達發揮抑制肺腺癌的生長與轉移作用。NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核質核胞質之間穿梭，具有多種功能，不僅與核糖體生物合成[15]、DNA復制和修復[16]、調節抑癌基因p53和p14的活性[17]、作為分子伴侶阻止蛋白集聚等過程密切相關，而且參與監控核仁活性及細胞增殖。本研究中，對照組中NPM蛋白呈高表達，而果王素理組NPM蛋白的表達及平均灰度值隨劑量遞增依次降低，且高劑量果王素處理組下降最明顯。結果表明，果王素可能通過抑制腫瘤組織中NPM蛋白過表達發揮抑制肺腺癌生長和轉移的作用。

綜上所述，果王素能明顯抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉移，其作用機制可能與抑制NPM蛋白的過表達有關。NPM在肺癌的發生發展中起癌基因作用，有可能成為肺癌靶向治療的潛在靶點。但肺癌的發病機制非常復雜，果王素抑制肺癌生長和轉移的作用機理仍有待更更一步探索。

參考文獻：

[1]Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

[2]Cao M， Chen W. Epidemiology of lung cancer in China[J].Thorac Cancer， 2019， 10（1）：3-7.

[3]Rosell R， Karachaliou N. Large-scale screening for somatic mutations in lung cancer [J]. Lancet， 2016，387：1354-1356.

[4]Hsu WH， Yang JC， Mok TS， et al.Overview of current systemic management of EGFR-mutant NSCLC[J]. Ann Oncol，2018，29：13-19.

[5]Liu L， Qian H， Yin H， et al. Unsaturated Fatty Acid of Actinidia Chinesis Planch Seed Oil Enhances the Antioxidative Stress Ability of Rats With Pulmonary Fibrosis Through Activating Keap1/Nrf2 Signaling Pathway[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi， 2016， 32 （4）： 479-483.

[6]賀兼斌，易高眾，向志，等.果王素對肺腺癌小鼠移植瘤轉移的抑制作用及機制[J].實用腫瘤雜志，2014，29（6）：527-532.

[7]劉理靜，周美玲，陳智魁，賀兼斌.中華獼猴桃果仁油非飽和脂肪酸（果王素）上調含EH結構域蛋白2（EH2）抑制肺腺癌小鼠移植瘤生長和轉移[J].細胞和分子免疫學雜志，2020，（07）：622-627.

[8]李祺福，石松林，劉慶榕， 等.人參皂甙R91組合誘導人成骨肉瘤MG-63細胞分化過程中Nucleophosmin的表達與定位變化[J]. 細胞生物學雜志，2008，30（7）： 265-272.

[9]Kassem N， Hamid A， Attia T， et al. Novel mutations of the nucleophosmin （NPM-1） gene in Egyptian patients with acute myeloid leukemia： A pilot study[J]. J Egypt Natl Canc Inst， 2011， 23（2）：73-78.

[10]劉巖，張飛，郭華，等.Nucleophosmin/B23 對結腸癌侵襲能力的影響[J].中國腫瘤臨床，2012，39（7）：373-376.

[11]Calli A.O， Sari A， Evcim G， et al. The enigmatic role of nucleophosmin in malignant melanoma： does it have an effect[J]. Indian J Pathol Microbiol， 2011，54（3）： 482-486.

[12]鄢超，毛瑞濤，馬淑霞，等.NPM1在結直腸癌的表達及臨床價值[J].標記免疫分析與臨床，2013，20（5）：285-287.

[13]石靜嫻.核仁磷酸化蛋白Nucleophosmin在人成骨肉瘤細胞中的功能與機制研究[D].廈門：廈門大學，2016.

[14]肖華，鄧湘，張平，賀兼斌.果王素對非小細胞肺癌化療效果的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，（02）：132-136.

[15]Adon AM， Zeng X， Llarrison MK， et al. Cdk2 and Cdk4 regulate the centrosome cycle and are critical mediators of centrosome amplify-cation in p53-null cells[J]. Mol Cell Biol，2010，30（3）：694-710.

[16]Federici L， Arcovito A， Scaglione G L， et al. Nucleophosmin C-terminal leukemia-associated domain interacts with G-rich quadruplex forming DNA[J]. J Biol Chem，2010，285（48）：37128-49.

[17]Kanai M， Crowe MS， Zheng Y， et al. RhoA and RhoC are bort required for the ROCK II-dependent promotion of centrosome duplication[J]. Oncogene，2010，29（45）：6040-6050.

作者簡介：鐘柏英（1985-09），女，漢族，湖南省臨武縣，南華大學附屬懷化醫院，主治醫生，研究生在讀，臨床醫學腫瘤方向。通訊作者：賀兼斌