基于分子對接和內質網應激探討老鼠簕生物堿A對小鼠急性肝損傷的作用*

梁英琴，徐萬鵬，王紅園，韋秀桂，孫雪梅，周煥芳，張 華，林 軍

（1.廣西醫科大學藥學院,南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥學部,南寧 530021）

肝臟是人體的重要器官，具有代謝、解毒和免疫等功能。當肝臟受到病毒、酒精和藥物等毒素和外源性物質刺激時，可引起肝細胞損傷，從而觸發炎癥導致細胞壞死，構成肝臟疾病的重要發病基礎[1]。肝損傷是一種嚴重的臨床綜合征，預后較差，可導致極高的死亡率，嚴重危害人民群眾的生命健康。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌產生的一種內毒素，具有引起巨噬細胞活化和強致炎作用，是造成肝臟損傷的重要藥物之一。研究表明，LPS 可引起小鼠體內氧化應激和炎癥，造成肝臟損害[2]。

肝臟中富含內質網（endoplasmic reticulum，ER），ER 是細胞加工脂質、蛋白質和貯存鈣離子的主要場所，也負責細胞外空間中蛋白的合成、修飾和釋放[3]。當肝臟受到損傷時，肝細胞內環境平衡遭到破壞，蛋白質的正確折疊受阻，未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網中，從而誘發內質網應激（ERS）。近年來相關研究發現，ERS 可能是多種肝臟疾病的發病機制之一，受損的肝細胞可觸發ERS 并導致肝細胞死亡[4]。因此，尋找減輕或者抑制ERS的有效藥物，對于肝臟疾病的治療具有重要意義。

老鼠簕生物堿A（4-羥基苯并噁唑-2-酮，HBOA）是本課題組從藥用紅樹林植物老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）中提取出的一種活性單體[5]。本課題組前期研究結果表明，HBOA 具有良好的減輕炎癥、抗肝纖維化的作用[6]，但對于LPS所致小鼠急性肝損傷ERS的作用還不明確。因此，本研究采用LPS建立小鼠急性肝損傷模型，從而評估HBOA對肝損傷所致的EPS的潛在影響及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 HBOA 由廣西醫科大學藥學院藥物化學教研室合成，純度＞98%。LPS（北京索萊寶科技有限公司）；聯苯雙酯滴丸（北京協和藥廠）。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；增強型BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、C/EBP 同源體蛋白（CHOP）、半胱天冬酶12（Caspase-12）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）抗體、白細胞介素1β（IL-1β）（博士德生物工程有限公司）；二抗（美國LICOR公司）。

1.2 主要儀器 連續光譜掃描式酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；雙色紅外激光成像系統（美國Odyssey LI-COR公司）；MICRO17R小型離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；SWB-20L-1恒溫搖床（美國Major Science 公司）；Olympus BX53 正置熒光顯微鏡；Nanodrop3000 微量核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher 公司）；MP-300V 電泳儀（美國Major Science 公司）。

1.3 實驗動物 SPF 級健康KM 雄性小鼠，體重18～22 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號為：SCXK（桂）2020-0003，使用許可證號為：SYXK（桂）2020-0004。小鼠飼養環境控制溫度為（23±2）℃，相對濕度為50%～70%，12 h/12 h光/暗循環。

1.4 分子對接 先從PubChem 數據庫獲取HBOA的三維分子結構，RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）獲取GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白質三維結構PDB格式。通過Pymol 2.4軟件對各分子進行去掉水分子、計算電荷等操作。其次使用Auto Dock Tools 1.5.6 軟 件將HBOA 和GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白結構的PDB 格式文檔均轉化為PDBQT 格式后進行分子對接。最后通過Pymol 軟件分析對接結果并進行可視化分析，篩選出最優對接構象。

1.5 動物分組及急性肝損傷模型的建立 將小鼠隨機分為6 組：正常組、模型組（LPS，10 mg/kg）、聯苯雙酯陽性藥組（150 mg/kg）及HBOA 高、中、低劑量組（200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg），每組10 只。藥物采用0.6%CMC-Na助溶，正常組和模型組小鼠用溶劑CMC-Na 灌胃，其余各組用相應藥液灌胃，1 次/d，連續灌胃10 d。末次給藥禁食不禁水12 h，除正常組外，其余各組均腹腔注射LPS（10 mg/kg）建立肝損傷模型。

1.6 樣本采集與處理 腹腔注射LPS 6 h 后，乙醚麻醉并頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟并用預冷的生理鹽水洗凈表面，濾紙吸干表面液體，稱取濕重量。切取每只小鼠的同一位置的肝臟小葉固定于4%多聚甲醛溶液中，剩下的肝臟分為4 份，保存于-80 ℃冰箱中。

1.7 肝臟LDH、GSH含量檢測 將肝臟從-80 ℃冰箱取出，解凍，用預冷的生理鹽水將其洗滌干凈。用濾紙將黏附在組織上的生理鹽水吸干后，切取適量組織，嚴格按照試劑盒說明書，對小鼠肝組織中LDH、GSH含量進行測定。

1.8 免疫組化法檢測肝組織中IL-1β水平 肝組織切片經二甲苯脫蠟、水化后，加入檸檬酸修復液，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，10%山羊血清封閉，滴加一抗IL-1β（1:500），4 ℃條件下孵育過夜；次日加入二抗（1:10 000），37 ℃下孵育0.5 h，隨后滴加DAB 顯色液，蘇木精復染，封片，置于顯微鏡下觀察、拍照，細胞質內棕黃色顆粒表示蛋白陽性表達。用Image Pro plus 6.0 軟件分析IL-1β 蛋白表達量，以平均光密度值表示蛋白的相對定量（平均光密度值=累積光密度值/陽性面積）。

1.9 Western blotting 法檢測肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12、TNF-α 和IL-6 的表達 采用液氮從小鼠肝組織中提取出蛋白液，BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。按蛋白樣本：SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）=1∶4 的比例將其混勻后，沸水中煮5 min變性。蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離1.5 h，后轉膜1.5 h 使蛋白轉移到PVDF 膜上。將PVDF 膜置于TBST 中洗滌3 次，每次5min，然后轉移到一抗中4 ℃下孵育過夜：GAPDH（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、CHOP（1∶800）、Caspase-12（1∶800）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）。孵育過夜的膜再用TBST 洗滌3 次后，放于二抗（1:10 000）中室溫孵育1 h，最后再用TBST 洗滌3 次，立即用Odyssey 掃膜儀進行掃膜，用Image J2X 軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH 為內參，目的蛋白條帶與相應內參條帶灰度值的比值為蛋白相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料用均數標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 分子對接結果 HBOA 與ERS 標志性蛋白GRP78 之間的結合能為-5.77 kcal/mol，HBOA 可與活性位點附近的GLU-202、ASP-35、THR-230、GLY-229、GLY-228、THR-38 這6 個氨基酸形成氫鍵結合到GRP78；HBOA 與TNF-α 之間的結合能為-5.83 kcal/mol，其可與活性位點附近VAL-150、LEU-93、HIS-15 這3 個氨基酸形成氫鍵結合到TNF-α；而HBOA與IL-1β之間的結合能為-5.48 kcal/mol，其可與活性位點附近LEU-26、LEU-82 這2 個氨基酸形成氫鍵結合到IL-1β；HBOA 與IL-6 之間的結合能為-5.36 kcal/mol，其可與活性位點附近VAL-154、PRO-152、LYS-85 這3 個氨基酸形成氫鍵結合到IL-6，見圖1。

圖1 HBOA與GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6對接后的最優構象圖

2.2 HBOA 對小鼠肝組織中LDH、GSH 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟中LDH含量顯著升高，GSH水平顯著降低（均P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和HBOA 高、中劑量組中LDH 含量顯著降低（P＜0.01），而陽性藥組和HBOA各劑量組中GSH含量顯著升高（P＜0.01），見表1。

表1 HBOA 對LPS 誘導的急性肝損傷小鼠肝組織LDH、GSH水平的影響，n=10

表1 HBOA 對LPS 誘導的急性肝損傷小鼠肝組織LDH、GSH水平的影響，n=10

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

2.3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中出現大量的棕黃色顆粒，表明IL-1β 蛋白水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA 給藥組棕黃色顆粒顯著減少，表明IL-1β 蛋白表達水平明顯受到了抑制（P＜0.01），見圖2。2.4 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6表達水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA高、中、低劑量組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖3、表2。2.5 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組肝組織中的GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA 高、中劑量組均顯著降低小鼠肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達水平（P＜0.01），見圖4、表3。

圖3 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達的影響

表2 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達的影響，n=3

表2 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達的影響，n=3

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

圖4 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達的影響

表3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達的影響，n=3

表3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達的影響，n=3

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

結合能反映受體與配體之間結合的可能性，結合能的高低能直接反映出受體與配體之間的親和力和構象穩定性。一般情況下，兩分子間的結合能小于0 kcal/mol時，視為有效對接。結合能越低，說明兩個分子在自然狀態下結合釋放的能量越低，即更易于結合。分子對接結果表明，HBOA與ERS標志蛋白GRP78 和炎癥相關蛋白（TNF-α、IL-1β、IL-6）之間的結合能均低于-5 kcal/mol，則具有良好的結合能力。以上提示了當炎癥和ERS 發生時，HBOA 可能通過抑制GRP78、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達來減輕ERS 和炎癥，但需要實驗來進一步驗證。

LPS 是革蘭陰性菌外細胞壁的主要糖脂成分，通常情況下，部分釋放的LPS 被門脈循環吸收，繼而傳遞到肝臟后被迅速清除。因此，肝臟在LPS進入機體和代謝調節過程中起著中心作用。LPS可誘導急性炎癥及一系列生化變化，如細胞因子和氧化應激增加，線粒體功能障礙，以及器官功能障礙等，與在人體中觀察到的變化高度相似，因此LPS常被用于誘導嚙齒類動物建立急性肝損傷模型[7]。

LDH水平是肝細胞毒性的一種酶標志物[8]。當肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，導致LDH 泄漏增加，因此LDH水平高低在一定程度上反映肝臟的受損程度。本研究中，HBOA 高、中劑量可降低LDH水平，說明HBOA可以對抗LPS對肝臟的毒性作用而達到保肝效果。

抗氧化劑防御系統的損傷是LPS 誘導肝臟損傷的關鍵環節。有研究表明，LPS 對肝臟的損傷以特征組織病變和循環中抗氧化酶、抗氧化分子水平的變化為特征，如谷胱甘肽(GSH)。GSH 因具有清除自由基和抗氧化的特性，因此被認為是一種高效的抗氧化化合物。GSH對于活性氧具有中和作用，在多種細胞功能的調節過程中至關重要。有研究表明，持續充足的GSH水平可以減輕LPS誘導的肝損傷[9]。本研究發現，模型組小鼠肝組織中GSH 含量顯著降低，表明LPS可使小鼠肝臟抗氧化能力降低；與模型組相比，HBOA 各給藥組GSH 含量顯著升高，提示HBOA在一定程度上逆轉了LPS對肝臟抗氧化系統的損害。

LPS引起的肝損傷也與炎癥介質緊密相關。據研究，LPS 可能激活轉錄因子NF-κB 導致許多炎癥因子的激活,如TNF-α，IL-1β[10]。TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子通過加速肝細胞凋亡而加重肝損傷，并與肝損傷的嚴重程度密切相關[11]。分子結果提示HBOA 可能通過與IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白結合，從而抑制炎癥反應。免疫組化結果顯示，HBOA 預處理可以降低LPS 誘導急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β蛋白水平；此外，Western blotting結果也表明HBOA 可降低模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達水平。提示HBOA 可能通過抑制炎癥反應從而對肝臟起到保護作用。

當氧化應激、缺氧、細胞毒性物質等不利因素作用于細胞時，細胞內環境穩態遭受破壞，未折疊或錯誤折疊的蛋白積聚在內質網中，誘發ERS。ERS介導的凋亡是細胞內源性凋亡途徑之一，有研究表明ERS 在急性肝損傷小鼠模型中發揮著重要的調節作用[12]。當發生ERS 時，未折疊蛋白反應（UPR）被激活以恢復內質網穩態，并降低機體損傷。適度的ERS 對細胞具有保護作用，但是，若應激信號嚴重或延長，內質網就會觸發細胞死亡途徑[13]。持續的ERS 會導致UPR 下游的促凋亡分子Caspase-12、CHOP 表達增加，引發細胞凋亡[14]。本實驗中，分子對接結果表明HBOA與GRP78之間具有較強的結合力。此外，急性肝損傷小鼠肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達均上調，說明肝損傷過程中伴隨著ERS的發生；而HBOA可以抑制這些蛋白的升高，提示HBOA 可以啟動UPR 反應，減少未折疊或錯誤折疊的蛋白在ER 腔內累積，從而恢復內質網的內穩態平衡。

綜上所述，HBOA 對LPS 所致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與恢復肝臟穩態、提高肝臟的抗氧化能力、抑制ERS、減輕炎癥、減少肝細胞凋亡等相關。