杜仲黃酮對糖尿病小鼠胰腺線粒體功能的影響*

范春惠，張琳惠，鄭 妮

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310000；2.南方科技大學(xué)醫(yī)院，深圳 518000）

線粒體是機(jī)體進(jìn)行氧化磷酸化、氧化代謝的細(xì)胞器，其為機(jī)體的生命活動合成機(jī)體必須的能量物質(zhì)腺苷三磷酸（ATP），同時具有調(diào)控活性氧（ROS）依賴的胞內(nèi)信號，參與細(xì)胞凋亡和自噬等生理作用[1]。2型糖尿病（T2DM）是因胰島組織生理或病理缺陷而造成β 細(xì)胞分泌胰島素不足，造成血糖升高。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 的出現(xiàn)與胰腺線粒體發(fā)生異常、線粒體氧化酶活性和肌肉脂質(zhì)代謝水平降低有密切關(guān)系[2]。因此，尋找改善線粒體作用的藥物對于T2DM的防治具有重要的意義。

杜仲黃酮是從杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥樹皮中提取的主要成分。有研究表明，杜仲黃酮對糖尿病及糖尿病腎病小鼠均有良好的治療作用[3-4]，但其具體機(jī)制尚未闡明。因此，本研究通過尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合高脂高糖飲食共同誘導(dǎo)構(gòu)建糖尿病小鼠模型，探討杜仲黃酮對糖尿病小鼠胰腺線粒體功能的影響，為T2DM的防治提供新思路及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠，SPF 級，18～22 g，購自浙江大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2019-0023。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h 光照晝夜循環(huán)。實驗開始前所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑

采用醇提取法提取杜仲黃酮：首先將干燥杜仲進(jìn)行充分粉碎，粉碎藥材置于容器中采用70%乙醇（藥材∶70%乙醇=1∶15），80 ℃加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3次。將提取液進(jìn)行過濾濃縮獲得干燥杜仲黃酮提取物。鹽酸二甲雙胍片（京豐制藥有限公司，批號：191115）；STZ（美國Sigma 公司）；高脂高糖飼料（武漢萬千佳興生物科技有限公司，批號:20191113）。總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、ROS、ATP 酶、ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ（ComplexI、Ⅲ）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；線粒體融合素1（Mfn1）、NF-E2 相關(guān)因子1（NRF1）抗體（英國Abcam公司）。

1.3 主要儀器

羅氏卓越型血糖儀（瑞士ACCU-CHEK Performa）；9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）；Mini-Protean Tetra 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜顯影設(shè)備、Gel-Doc EZ 凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 造模與分組[5]

小鼠尾靜脈注射STZ（25 mg/kg）1次，高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周后檢測小鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥11.1 mmol/L 為T2DM 模型成功。將T2DM 模型小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、杜仲黃酮低劑量組、杜仲黃酮高劑量組，每組10 只。另以健康昆明小鼠為空白對照組。二甲雙胍組予32 mg/kg 二甲雙胍混懸溶液，杜仲黃酮高、低劑量組分別予160 mg/kg、80 mg/kg杜仲黃酮混懸溶液，各組灌胃予相對應(yīng)藥物60 d，1次/d。模型組和正常對照組小鼠灌胃予等體積生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

分別于給藥前及末次給藥2 h 后，血糖儀檢測FBG。眼眶靜脈采集小鼠血液，離心，取血清待測。切除部分胰腺組織，制備成10%的勻漿液。另切取部分胰腺組織，-80℃保存待測。

1.5.1 血清胰島素（FNS）、抗氧化因子及FBG檢測 將分離所得的血清復(fù)溶，采用ELISA 法，按說明書操作分別檢測血清中FNS、T-AOC 含量及SOD、CAT活性。

1.5.2 胰腺中線粒體功能因子及ROS 檢測 將胰腺組織制備成10%勻漿液，采用ELISA 法，按說明書操作分別檢測胰腺組織中ATP酶、線粒體呼吸鏈ComplexⅠ、Ⅲ活性及ROS、ATP含量。

1.5.3 Western blotting 法檢測胰腺組織NRF1 和Mfn1 蛋白表達(dá) 將胰腺組織剪碎后，加入RIPA 裂解液，置于研磨器中低溫充分研磨，0℃下靜置1 h。1.2×104r/min，4℃，離心10 min。吸取上清液，BCA蛋白定量、煮蛋白。制備SDS-PAGE 凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗NRF1（1∶1 000）、Mfn1（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃下靜置孵育12 h；TBST 液洗滌，加二抗（1∶2 000），室溫下慢搖1 h，TBST 液洗滌，ECL 發(fā)光液顯色，曝光。GelDoc EZ凝膠電泳成像分析系統(tǒng)對目標(biāo)蛋白灰度/內(nèi)參灰度進(jìn)行灰度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H秩和檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠FBG、FNS水平比較

與空白對照組比較，模型組小鼠給藥后的FBG明顯升高、血清中FNS 含量減少（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、杜仲黃酮組小鼠FBG 均降低，血清中FNS 含量增加（P＜0.05）；杜仲黃酮高劑量組FBG 水平顯著低于低劑量組，血清FNS水平高于低劑量組（P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠FBG、FNS水平比較，n=10

表1 5組小鼠FBG、FNS水平比較，n=10

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與二甲雙胍組比較，& P＜0.05，& & P＜0.01；與杜仲黃酮高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.2 5組小鼠抗氧化因子及ROS含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠胰腺T-AOC含量減少，SOD、CAT 活性降低，ROS 含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、杜仲黃酮組小鼠胰腺T-AOC含量增加，SOD、CAT活性提高，ROS含量減少（P＜0.05）；杜仲黃酮高劑量組較低劑量組TAOC 含量及SOD、CAT 活性高，ROS 含量少（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 5組小鼠抗氧化因子及ROS含量比較，n=10

表2 5組小鼠抗氧化因子及ROS含量比較，n=10

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與二甲雙胍組比較，& P＜0.05，& & P＜0.01；與杜仲黃酮高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 5組小鼠線粒體功能因子水平比較

與空白對照組比較，模型組ATP 含量明顯降低，Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP 酶活力減弱（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、杜仲黃酮組小鼠胰腺ATP 含量明顯增加，Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP酶活力增強(qiáng)（P＜0.05）；杜仲黃酮高劑量組較低劑量組ATP 含量及Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP 酶活力高（P＜0.05），見表3。

表3 5組小鼠線粒體功能因子水平比較，n=10

表3 5組小鼠線粒體功能因子水平比較，n=10

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與二甲雙胍組比較，& P＜0.05，& & P＜0.01；與杜仲黃酮高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 5 組小鼠胰腺組織NRF1、Mfn1 蛋白表達(dá)量比較

與空白對照組比較，模型組胰腺NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、杜仲黃酮組小鼠胰腺線NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；杜仲黃酮高劑量組較低劑量組NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)高（P＜0.05或P＜0.01），見表4、圖1。

表4 5組小鼠胰腺組織NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)量比較，n=10

表4 5組小鼠胰腺組織NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)量比較，n=10

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與二甲雙胍組比較，& P＜0.05，& & P＜0.01；與杜仲黃酮高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

圖1 Western blotting蛋白電泳圖

3 討論

研究表明，杜仲黃酮在治療骨質(zhì)疏松、急性肺損傷及糖尿病方面有顯著療效，并均有降血壓、降血脂、抗腫瘤、強(qiáng)筋健骨及降血糖等豐富藥理作用[6]。最新研究表明，杜仲黃酮可糾正糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂，通過改善氧化應(yīng)激狀態(tài)對胰島細(xì)胞及腎臟組織具有保護(hù)作用，但其潛在作用機(jī)制尚未完全明確[3,7]。研究認(rèn)為，線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過多ROS 是導(dǎo)致胰島素抵抗、β 細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損及功能障礙的關(guān)鍵因素[8-9]。因此，本研究旨在深入研究杜仲黃酮抗糖尿病機(jī)制是否與改善線粒體功能，減少ROS產(chǎn)生所致的氧化應(yīng)激相關(guān)。

線粒體是機(jī)體的能量代謝中心，在不同的生理或病理狀態(tài)下，線粒體具有調(diào)節(jié)其功能及在不同內(nèi)環(huán)境下調(diào)整能量供應(yīng)的能力[10]。胰島素抵抗（IR）及T2DM病程的進(jìn)展與線粒體功能異常有著重要的關(guān)系[11]。胰腺組織線粒體的腫脹、外膜破裂、線粒體DNA 損傷、呼吸鏈抑制等，線粒體生成和氧化磷酸化能力下降，會造成能量代謝障礙，形成一系列相互作用的損傷過程[12]。

線粒體代謝失衡是造成胰腺代謝功能異常的重要原因。線粒體的氧化還原反應(yīng)平衡遭到破壞時，過量的強(qiáng)氧化分子ROS 生成，組織內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡被打破[13]。ROS的異常堆積，氧化應(yīng)激損傷破壞其內(nèi)部的蛋白、線粒體DNA和線粒體膜上脂類，酶類、呼吸鏈復(fù)合物活性及氧化磷酸化水平降低，其合成ATP的能力下降，GSK-3蛋白激酶的蛋白質(zhì)磷酸化效率降低，進(jìn)而影響胰島素信號通路、葡萄糖代謝、胰島β細(xì)胞功能等胰腺代謝功能，可導(dǎo)致T2DM 的發(fā)生及發(fā)展[14-15]。T-AOC能反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化損傷程度，其在機(jī)體中的含量與機(jī)體的抗氧化能力呈正相關(guān)。Complex Ⅰ、Ⅲ是位于線粒體內(nèi)膜的線粒體呼吸鏈酶，對線粒體活性氧及終端的電子受體的生成有著重要的作用。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能提高T2DM 小鼠血清中抗氧化因子T-AOC 含量及增加SOD、CAT 的活性，同時增加胰腺線粒體中Complex Ⅰ、Ⅲ及ATP 酶活性及ATP 含量，降低ROS 的含量。提示，杜仲黃酮能提高機(jī)體的抗氧化能力及降低ROS的含量，恢復(fù)線粒體正常的代謝功能。

胰島細(xì)胞線粒體數(shù)量下降是糖尿病發(fā)病及病程進(jìn)展的重要條件[16]。研究表明，T2DM 患者胰腺中線粒體體積、數(shù)目明顯低于正常人，可認(rèn)為線粒體分裂與融合的動力學(xué)狀態(tài)失衡，而線粒體分裂融合動力學(xué)的失衡是引起胰島素抵抗，誘發(fā)T2DM 形成的始動因素之一[17]。線粒體生物合成因子和融合因子的表達(dá)在一定程度上代表線粒體的數(shù)量及功能狀態(tài)，是平衡線粒體呼吸所產(chǎn)生的氧自由基的量，保證膜結(jié)構(gòu)完整及維持正常膜電位，防止細(xì)胞凋亡的重要因子[18]。線粒體間的融合依賴于定位于線粒體外膜的融合蛋白Mfn1。當(dāng)Mfn1 受損時，增加ROS 的生成，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙[19]。線粒體生物合成因子NRF1廣泛參與線粒體的生物合成，與核基因啟動子結(jié)合，正性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，增加線粒體生成數(shù)量[20]。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能增加胰腺中NRF1、Mfn1蛋白表達(dá)。提示，杜仲黃酮能調(diào)節(jié)胰腺組織中線粒體生物合成因子和融合因子的表達(dá)。

綜上所述，杜仲黃酮能降低T2DM 小鼠血糖，增加血清胰島素、T-AOC含量及CAT、SOD活性，同時增加胰腺中ATP含量及ATP酶、ComplexⅠ、Ⅲ活力，減少ROS 含量，提高NRF1 和Mfn1 蛋白表達(dá)。杜仲黃酮抗T2DM 的作用機(jī)制可能為干預(yù)線粒體融合與分裂、減少ROS 生成及堆積、提高機(jī)體抗氧化能力、增加胰腺線粒體數(shù)量及提高線粒體的代謝功能有關(guān)。