平喘顆粒對氣道高反應大鼠氣道重塑的干預作用研究*

蔣鵬娜，張佩青，王麗潔

（1.黑龍江省中醫藥科學院，哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱 150040）

隨著環境的惡化、空氣質量的下降，工業廢氣和機動車尾氣的排放，哮喘患者的發病率和死亡率逐年上升，國內外學者的研究發現，哮喘的發病主要表現為氣道高反應、氣道重塑以及氣道炎性改變[1]。在慢性氣道炎性改變的發展過程中，由于炎性細胞的刺激浸潤，加之結構細胞和細胞組分的參與，導致氣道黏膜的不斷損傷和修復，介導了氣道上皮的氣道重塑。前期的研究表明，氣道高反應大鼠的氣道病理特征是炎性細胞的浸潤和肌成纖維細胞數量增多，而肌成纖維細胞是細胞外基質沉積和氣道上皮細胞間質轉化的關鍵細胞[2]。在長期反復的慢性炎癥刺激下，細胞的凋亡和自噬使得氣道上皮細胞功能發生了間質轉化，在這個發展過程中如何調控氣道上皮細胞的功能，減輕間質轉化，延緩氣道重塑，顯得尤為重要。通過長期的臨床實踐觀察發現，平喘顆粒在減輕哮喘的癥狀，調控哮喘的免疫應激、凋亡、自噬中發揮了良好的臨床效果[3]。本文旨在通過建立氣道高反應動物模型，觀察平喘顆粒對干預上皮細胞間質轉化、氣道膠原蛋白沉積等指標的影響，探討平喘顆粒延緩氣道重塑的作用機制，為研發哮喘新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar 大鼠48 只，雌雄各半，購于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心，許可證號：SYXK（黑）2015-003，體重：(200±20) g，雌雄分籠飼養，自由飲食，在室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%條件下適應性喂養，觀察大鼠在進食、飲水、二便、活動方面均無異常，1周后正式進行動物實驗。

1.2 實驗藥品與試劑

雞卵清蛋白（OVA）（美國Sigma），滅活百日咳桿菌疫苗（北京生物制品研究所），Collagen Ⅰ（Proteintech），Collagen Ⅲ（Proteintech），TGF β1（Proteintech），山羊抗兔IgG（H+L），HRP（天德悅），山羊抗鼠IgG（H+L），HRP（天德悅），β-actin鼠單抗（金斯瑞），蛋白抽提試劑（賽諾博），BCA蛋白定量試劑盒（賽諾博）。

1.3 實驗儀器

Fresco21 低溫冷凍離心機（Thermo），Multi-Skan3 酶標儀（Thermo），Mini P-4 電泳槽（Cavoy MP-8000），濕轉電泳槽（Cavoy MP-3030），電泳儀（Bio-Rad Power BC），水平脫色搖床（其林貝爾TS-2）。

1.4 實驗藥物

OVA 致敏液配制：1 mg OVA 與100 mg 氫氧化鋁凝膠（10%）加入1 mL 無菌生理鹽水，現用現配。平喘顆粒：淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母九味藥物組成，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制備，規格：10 g/袋，批號：20150102。根據人（70 kg）與大鼠（200 g）給藥劑量比值1∶0.018 換算后[4]，加水稀釋至0.54 g/mL，每次按1 mL/100 g灌胃。

1.5 實驗方法

1.5.1 大鼠分組 將48只Wistar大鼠，適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組（B組）、治療組（平喘顆粒組）3組，每組16只。

1.5.2 氣道高反應模型的建立與給藥 3組大鼠在造模過程中均分為致敏和激發兩階段[5]，空白組用生理鹽水代替進行致敏和激發，其余兩組在實驗開始后1 d、14 d和21 d，在大鼠四肢內側和腹腔，每處給予0.2 mL抗原液皮下注射致敏，同日用含有高溫殺死的6×109/mL 百日咳桿菌菌苗1 mL 腹腔注射，并于第28～34 天將其放入與小動物霧化給藥儀相連的30 cm×30 cm×20 cm 自制玻璃箱中，給予1%OVA 的生理鹽水溶液持續霧化30 min，1 次/d，連續定時激發5d，后每隔日激發1 次，共激發6 周，造成氣道高反應大鼠模型。治療組在末次致敏后第4天開始給予中藥（平喘顆粒）灌胃，藥物灌胃劑量為1 mL/100 g，1次/d。空白組和模型組用相應劑量生理鹽水（1 mL/100 g）灌胃。有激發階段時，則在激發前1 h完成藥物灌胃。

1.5.3 取材與樣品處理 各組大鼠于末次激發24 h后處死，于無菌操作臺，打開胸廓暴露肺臟，取出右肺，PBS沖洗，分別剪取前葉和中葉，用4%多聚甲醛溶液固定前葉，中葉置于EP 管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱，Western Blot檢測備用。

1.5.4 肺組織病理形態學檢測 肺組織的固定及石蠟切片將4%多聚甲醛固定的肺組織經過梯度脫水、二甲苯透明后進行浸蠟包埋固定，最后切4 μm薄片，烘干備用，進行HE、Mallory染色。HE、Mallory 染色嚴格按照操作步驟進行，其中Mallory 染色后，膠原纖維和網狀纖維呈藍色。

1.5.5 免疫組化法檢測肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達 將4 μm石蠟包埋的肺組織薄片進行脫蠟后，按照操作洗滌、孵育、浸泡后，用山羊血清封閉，然后進行一抗、二抗等操作后封片拍照后進行200 倍光鏡觀察，隨機選取5個視野，測定著色細胞平均吸光度（OD），用Image-Pro Plus 圖像分析儀對圖像進行分析，計算其平均值作為該切片的代表值。

1.5.6 Western blotting 檢測肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF β1 蛋白表達 將大鼠肺組織取出后剪碎，稱重后以1∶9比例加入（含有抑制劑的蛋白質抽提試劑）的RIPA裂解液，進行組織勻漿，低溫離心后，取上清即為所抽取的大鼠肺組織蛋白，分裝EP管中，做好標記，-80 ℃保存以備檢測，各組可留取少量上清用以調整蛋白濃度。配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。電泳，濕轉，封閉，孵育，洗膜，顯色，拍照，標marker條帶。最后再經過洗膜、孵育顯色過程得到內參照的條帶。最后用化學發光成像儀顯影并以β-actin 條帶光密度值歸一化各目的蛋白水平。

1.6 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件對數據進行統計處理，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織HE染色結果

空白組：整體結構完整，肺泡內肺泡管及肺泡囊輪廓清晰，肺泡腔大小均勻，肺泡壁及支氣管柱狀上皮細胞呈單層結構排列，整齊有序。模型組：整體結構破壞嚴重，支氣管及血管外周被炎性細胞廣泛浸潤，肺泡管、肺泡囊及肺泡壁結構消失。治療組：肺泡腔、肺泡壁整體結構較完整，支氣管及血管外周可見中等量炎性細胞浸潤，肺泡腔中可見少量塵細胞，組織中可見多個炎性細胞浸潤灶，見圖1。

圖1 各組大鼠HE 染色結果（×200）

2.2 各組大鼠肺組織Mallory染色結果

空白組：肺組織中肺泡細胞周圍無炎性滲出，結構完整，少量膠原分布于細胞間質及支氣管周圍。模型組：肺組織中肺泡腔基本消失，未見完整肺泡結構，大量藍色膠原纖維充斥于肺泡間質、氣管和血管周圍。治療組：肺組織中肺泡腔結構較為完整，膠原纖維較模型組明顯減少，肺泡間質、氣管和血管周圍可見藍色膠原纖維，見圖2。

圖2 各組肺組織Mallory染色結果（×200）

2.3 免疫組化法檢測各組大鼠肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達

COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白染色呈藍色顆粒，位于核膜或胞質內，見圖3。結果表明，模型組和平喘顆粒組的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表達均顯著高于空白組（均P＜0.01）。治療組COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白的表達較模型組明顯受到抑制（均P＜0.01）,見表1。

表1 各組大鼠肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表達

表1 各組大鼠肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表達

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

圖3 各組肺組織COL-I免疫組化（×200）

圖4 各組肺組織COL-Ⅲ免疫組化（×200）

3.4 Western blotting 檢測肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1蛋白表達水平

用Western blotting蛋白免疫印跡法檢測氣道高反應大鼠肺組織內COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1 蛋白的表達水平，并對其條帶灰度值進行定量分析。結果顯示，模型組和治療組肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1表達較空白組顯著增高（均P＜0.05），其中治療組肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1 表達較模型組顯著降低（均P＜0.05），見圖5，表2。

圖5 各組肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF β1的表達

表2 各組大鼠肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達水平

表2 各組大鼠肺組織中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達水平

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3 討論

祖國醫學認為支氣管哮喘與喘病和哮病相類，東北屬于黑土寒地，肺司呼吸，長久受寒涼侵襲，衛氣受損，肺氣不足，宣降失常，咳喘常作，脾為土，肺為金，腎為水，五行相生，子病及母，母病及子，故肺脾腎一氣而動，日久三臟俱損，脾虛生濕，濕多痰聚，留伏于體內，成為宿根，故哮喘纏綿難愈。在臨證中常將哮喘歸為“哮證”范疇，“痰飲夙根”是其發病關鍵，與肺脾腎相關。臨床發現哮喘多虛實夾雜，因虛致實，因實致虛，反復加重，使得陽虛與痰濁疊加，即陽虛亦甚，痰濁復加；痰濁復加，虛損亦重，其病機在“陽虛痰盛”，治療應以“溫陽益氣、平喘化痰”為主，常用平喘顆粒方加減。

平喘顆粒是劉建秋教授治療哮喘慢性持續期的經典代表方[2]，全方以“陽虛痰盛”立方，以溫陽益氣為主，兼以平喘化痰，綜觀全方溫陽利濕，陽氣足濕氣化，益氣納腎，一身之氣足則喘平氣順，補中有消，溫中有行，肺脾腎三臟同調，由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母組成。

前期病理研究發現，哮喘患者的氣道黏膜組織存在不同程度的氣道重塑，病理組織經HE 染色證實，氣道上皮受損，脫落明顯，杯狀細胞聚集增生導致基底膜增厚，氣道上皮出現纖維化改變[6-8]。氣道上皮下膠原的沉積及纖維黏連蛋白的過度表達是由于哮喘發作時激活肺成纖維細胞而加重，又進一步增厚基底膜[9-12]。

蔣鵬娜等[13]研究發現，PI3K/Akt 信號通路可以介導TGF β1誘導氣道上皮細胞基底層增厚，而平喘顆粒能夠明顯抑制ERK1/2 的磷酸化，降低JNK 的表達而抑制TGF β1 誘導的氣道上皮細胞間質轉化。而本實驗發現，平喘顆粒能夠分別明顯降低肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達水平、抑制TGF β1 的表達，表明平喘顆粒可能通過抑制TGF β1的過度表達，減少COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的增生，從而減輕氣道重塑。在造模的過程中可以發現，隨著卵蛋白霧化和刺激的時間積累，大鼠開始出現不同程度的呼吸急促、張口呼吸、腹部翕動、煩躁不安，這也間接說明大鼠的氣道出現了不可逆或部分可逆的氣流受限，病理結果也證實大鼠氣道基底膜增厚、平滑肌增厚、杯狀細胞化生、細胞外基質增加[14-15]，氣道上皮細胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白增多，導致氣道的剛性增加，肺順應性降低[16-17]。而且，模型組大鼠的一般狀態隨病程的遷延進行性加重，也說明氣道重塑隨時間累計逐漸加重。另外，氣道上皮細胞分泌的細胞外基質[18]，又會加重平滑肌細胞的間質轉化[19]，又促進了氣道重塑。本實驗發現，平喘顆粒的使用能減少氣道上皮細胞外基質Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達，同時還能抑制氣道總管壁、內壁以及氣道平滑肌的增厚。

綜上，本研究證實平喘顆粒可以抑制甚至逆轉氣道高反應大鼠的氣道重塑，抑制肺成纖維細胞激活，使TGF β1 的表達降低，減少了CoL Ⅰ和Col Ⅲ的表達，減少了基底膜增厚和膠原沉積，發揮了抗纖維化的作用，其機制可能與PI3K/Akt/MAPK相關信號通路的表達有關[20]。