60Co－γ射線誘變創(chuàng)制苦蕎品系的黃酮和蛋白質(zhì)含量分析

石桃雄，關(guān)志秀，韋春玉，李紅興，汪燕，梁成剛

（貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001）

蕎麥?zhǔn)请p子葉蓼科蕎麥屬（FagopyrumMill）植物，包含甜蕎（F．esculentumMoench）與苦蕎［F．tataricum（L.）Gaertn］兩個(gè)栽培種［1，2］。蕎麥的種子蛋白質(zhì)含量較高，且富含蘆丁等黃酮類物質(zhì)，是我國(guó)重要的雜糧作物［1，2］。早在1946年甜蕎種子就被認(rèn)為是提取蘆丁的優(yōu)質(zhì)原料，而苦蕎蘆丁含量一般為甜蕎的3～5倍，保健價(jià)值更為突出［3－5］。歷史上苦蕎是彝族人民的主糧，也可作為一種救災(zāi)填閑作物［6］。苦蕎種子蛋白質(zhì)以清蛋白和谷蛋白為主，這與水稻等谷物的種子蛋白質(zhì)組分比例不同，且苦蕎種子蛋白質(zhì)中賴氨酸含量豐富，比例合理，適宜人體吸收利用［7，8］。近來(lái)隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明苦蕎種子黃酮對(duì)于“三高”人群的療效顯著，因此，圍繞種子黃酮開展的品質(zhì)及保健功能研究等較多［8，9］。苦蕎種子多酚成分及比例與水果多酚相似，而與玉米等谷物不同，苦蕎總多酚含量與自由基清除能力呈線性相關(guān)［10－12］。目前普遍認(rèn)為，苦蕎中活性物質(zhì)不僅對(duì)2型糖尿病具有較好的輔助治療效果，還具有較強(qiáng)的清除自由基能力以及抗氧化活性［8－14］。隨著生活水平的日益提高以及人們對(duì)苦蕎營(yíng)養(yǎng)與保健功效的認(rèn)識(shí)，苦蕎產(chǎn)品越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的追捧。

目前，苦蕎雜交育種工作開展緩慢，主栽品種大多是以常規(guī)育種方法育成［15］。輻射誘變育種是苦蕎高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種較為常用的方法之一［16］。晉蕎麥2號(hào)是原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)國(guó)審苦蕎品種［17］。對(duì)晉蕎麥2號(hào)進(jìn)行引種發(fā)現(xiàn)，在貴州地區(qū)晉蕎麥2號(hào)不僅表現(xiàn)出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)特性，而且具有總黃酮含量較高等特性［18］。此外，低氮與低磷處理發(fā)現(xiàn)，晉蕎麥2號(hào)為耐低氮、磷高效品種［7，19］。因此，本課題組以晉蕎麥2號(hào)為材料進(jìn)行60Co－γ射線輻射誘變，創(chuàng)制突變種質(zhì)資源，以期為下一步苦蕎的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種以及基因功能研究提供材料。本研究即選用其中單株產(chǎn)量較高的株系為材料，對(duì)其種子的主要營(yíng)養(yǎng)與保健成分進(jìn)行檢測(cè)，為今后苦蕎的優(yōu)質(zhì)育種以及產(chǎn)品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年以晉蕎麥2號(hào)為材料，使用60Co－γ射線（200、400、600 Gy）對(duì)30 000余粒種子進(jìn)行輻射誘變。本試驗(yàn)即以誘變創(chuàng)制的49份具有高產(chǎn)潛力的M6代種子為材料，以野生型晉蕎麥2號(hào)（JQ2）為對(duì)照。供試材料見表1。

表1 供試材料及編號(hào)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 將各品系種子分為3份，置于60℃烘箱中烘干，冷卻后去殼，并用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，供品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定使用。

1.2.2 總黃酮與總多酚含量的測(cè)定 稱取0.05 g樣品于2 mL離心管中，加入80%的乙醇1.5 mL并振蕩搖勻，在70℃下浸取5 h（期間振蕩搖勻5次），再利用超聲提取10 min，最后在2 000 r／min下離心2 min，取上清液，待測(cè)。總黃酮的測(cè)定參考汪燕等［7］的方法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算；總多酚含量的測(cè)定參考孫丹等［20］的方法，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 蛋白質(zhì)組分的測(cè)定 參考汪燕等［7］的方法，稱取0.10 g樣品置于瓷研缽中，依次加入清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白提取液進(jìn)行提取并測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎種子總黃酮含量的分析

由表2可知，49份苦蕎材料的種子總黃酮含量在7.55～32.05 mg／g間，平均為20.52 mg／g總黃酮含量高于20.00 mg／g的材料有32份，低于10.00 mg／g的材料有7份，顯著或極顯著高于對(duì)照的材料有19份，極顯著低于對(duì)照的材料有13份。其中，LW－16和LW－76的總黃酮含量達(dá)到30.00 mg／g以上，為高黃酮含量苦蕎材料較對(duì)照分別提高52.28%和52.47%；LW－69的總黃酮含量為7.55 mg／g，為低黃酮含量苦蕎材料，較對(duì)照降低64.09%。

表2 苦蕎種子的總黃酮含量 （mg／g）

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2.2 苦蕎種子總多酚含量的分析

由表3可知，49份苦蕎材料的種子總多酚含量在4.55～11.76 mg／g之間，平均含量為8.21 mg／g。總多酚含量為10.00 mg／g及以上的材料有4份，低于5.00 mg／g的材料有1份，含量顯著或極顯著高于對(duì)照的材料有4份，顯著或極顯著低于對(duì)照的材料有7份。其中LW－52和LW－57為高多酚苦蕎材料，總多酚含量達(dá)到11 mg／g以上，較對(duì)照分別提高35.50%和39.17%；LW－16總多酚含量為4.55 mg／g，為低多酚苦蕎材料，較對(duì)照降低46.15%。

表3 苦蕎種子的總多酚含量 （mg／g）

2.3 苦蕎種子蛋白質(zhì)組分含量的分析

由表4可知，49份苦蕎種子總蛋白含量在55.51～116.08 mg／g之間，平均88.85 mg／g。其中，LW－57和LW－17種子總蛋白含量分別為116.08 mg／g和110.38 mg／g，較對(duì)照分別提高20.34%和14.43%，達(dá)顯著或極顯著水平；12份材料的種子總蛋白含量顯著或極顯著低于對(duì)照，LW－25和LW－46為低蛋白含量苦蕎材料，種子總蛋白含量分別為55.51 mg／g和58.49 mg／g，分別較對(duì)照降低42.45%和39.36%。

表4 苦蕎種子的總蛋白含量 （mg／g）

由表5可知，49份苦蕎材料的清蛋白含量在3.24～67.04 mg／g間，變異系數(shù)達(dá)到31.14%，平均含量為43.31 mg／g，占總蛋白含量的48.75%。其中，LW－25種子的清蛋白含量最低，較對(duì)照降低91.63%；LW－37種子的清蛋白含量最高，較對(duì)照提高73.29%。

表5 苦蕎種子的蛋白質(zhì)組分含量及比例

49份苦蕎材料的球蛋白含量在0.37～6.40 mg／g間，變異系數(shù)達(dá)到54.08%，平均含量為2.38 mg／g，占總蛋白含量的2.68%。其中，LW－25種子的球蛋白含量最低，較對(duì)照降低90.05%；LW－59種子的球蛋白含量最高，較對(duì)照提高72.04%。

49份苦蕎材料的醇溶蛋白含量在1.42～6.75 mg／g間，平均含量為3.66 mg／g，變異系數(shù)達(dá)到25.18%。其中，LW－42種子的醇溶蛋白含量最低，較對(duì)照降低78.91%；LW－76種子的醇溶蛋白含量最高，較對(duì)照提高0.25%。

49份苦蕎材料的谷蛋白含量在25.59～63.32 mg／g間，平均含量為39.50 mg／g，變異系數(shù)達(dá)到25.54%。其中，LW－42種子的谷蛋白含量最低，較對(duì)照降低45.93%；LW－17種子的谷蛋白含量最高，較對(duì)照提高33.80%。

2.4 苦蕎種子主要營(yíng)養(yǎng)與保健成分的相關(guān)性分析

對(duì)苦蕎種子主要營(yíng)養(yǎng)與保健成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表6）發(fā)現(xiàn)，苦蕎種子總多酚含量與清蛋白含量（0.347**）和總蛋白含量（0.322**）呈極顯著正相關(guān)；總黃酮含量與醇溶蛋白含量（0.226**）和谷蛋白含量（0.178*）呈極顯著和顯著正相關(guān)，與球蛋白含量（－0.445**）呈極顯著負(fù)相關(guān)；清蛋白含量與總蛋白含量（0.714**）呈極顯著正相關(guān)，與谷蛋白含量（－0.282**）呈極顯著負(fù)相關(guān)；醇溶蛋白含量與谷蛋白含量（0.243**）和總蛋白含量（0.162*）呈極顯著或顯著正相關(guān)；谷蛋白含量與總蛋白含量（0.462**）呈極顯著正相關(guān)。

表6 苦蕎種子總黃酮、多酚和蛋白質(zhì)組分的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

苦蕎種子富含黃酮類生物活性成分，不僅具有降血糖、降血壓、降血脂等顯著療效，在清除自由基能力以及抗氧化等方面也具有明顯效果［8－14］。呂丹等［21］研究表明，212份苦蕎種質(zhì)總黃酮的含量范圍為1.02%～2.84%，平均值為2.05%。本研究發(fā)現(xiàn)輻射誘變對(duì)苦蕎種子總黃酮含量影響較大，49份苦蕎材料的總黃酮含量在7.55～32.05 mg／g間，與野生型晉蕎麥2號(hào)比，19份材料種子總黃酮含量顯著或極顯著提高，13份材料極顯著降低。其中，LW－16和LW－76為高黃酮含量苦蕎材料，LW－69為低黃酮含量苦蕎材料，可作為優(yōu)質(zhì)育種或次生代謝研究的重要材料。

苦蕎種子多酚含量與抗氧化活性密切相關(guān)，苦蕎多酚不僅能改善內(nèi)皮胰島素抵抗，另外其游離酚提取物還能顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖［10－12］。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射誘變對(duì)苦蕎種子多酚含量影響較大，49份材料的總多酚含量在4.55～11.76 mg／g之間，顯著或極顯著高于對(duì)照的有4份，顯著或極顯著低于對(duì)照的有7份。其中LW－52和LW－57為高多酚品系，可作為苦蕎優(yōu)質(zhì)育種的重要候選材料。

苦蕎蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸比例均衡，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適宜人體吸收利用［22］。除此之外，Zhang等［13］研究發(fā)現(xiàn)苦蕎蛋白還具有降血脂等保健功效。李紅梅［14］和汪燕［7］等研究發(fā)現(xiàn)苦蕎種子蛋白質(zhì)組分以清蛋白與谷蛋白為主，本研究也發(fā)現(xiàn)苦蕎種子蛋白質(zhì)組分中清蛋白與谷蛋白含量最高。體外抗氧化能力研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎種子蛋白質(zhì)組分中清蛋白和球蛋白具有抑制超氧陰離子自由基產(chǎn)生和清除羥自由基等功效［14］。不過(guò)，苦蕎種子球蛋白含量較低，平均為總蛋白的2.68%，因此，選育高清蛋白含量品種可作為苦蕎優(yōu)質(zhì)育種的重要目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，LW－37種子清蛋白含量達(dá)到67.04 mg／g，較對(duì)照提高73.29%，可作為苦蕎優(yōu)質(zhì)育種的重要候選材料。

苦蕎是我國(guó)重要的雜糧作物，其種子富含蛋白質(zhì)以及蘆丁等黃酮類物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和食療功效［5，6］。苦蕎優(yōu)質(zhì)育種非常重視種子中蛋白質(zhì)、總黃酮含量等指標(biāo)。苯丙氨酸不僅是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸，也是黃酮類次生代謝物的主要前體物質(zhì)［23］。相關(guān)性分析結(jié)果表明，苦蕎總蛋白、清蛋白含量與總多酚含量呈極顯著正相關(guān)，谷蛋白、醇溶蛋白含量與總黃酮含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，說(shuō)明選育兼具高蛋白、高黃酮和高多酚含量的苦蕎品種具有可能性。

受限于苦蕎花朵小、雜交工作開展較難等因素，苦蕎雜交優(yōu)質(zhì)育種研究進(jìn)展較為緩慢［15，16］。本研究利用60Co－γ射線對(duì)苦蕎進(jìn)行輻射誘變，發(fā)現(xiàn)49份材料種子總黃酮含量的變異系數(shù)達(dá)到35.52%，總多酚含量的變異系數(shù)達(dá)到19.27%，總蛋白含量的變異系數(shù)達(dá)到16.24%，說(shuō)明60Coγ射線輻射誘變可為苦蕎優(yōu)質(zhì)育種的有效途徑；而且60Co－γ射線輻射創(chuàng)制的營(yíng)養(yǎng)成分含量發(fā)生極端變化的材料，如LW－25為低清蛋白和球蛋白材料，可為苦蕎的基因功能研究提供材料。