汞脅迫對草坪草及牧草幼苗生理及養分積累特性的影響

杜建雄,任尉香,張淑卿,李劍峰,周丕飛

(1.貴州財經大學 管理科學學院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州師范大學 外國語學院 貴州 貴陽 550025； 3.貴州師范學院 喀斯特生境土壤與環境生物修復研究所, 貴州 貴陽 550018)

0 引言

【研究意義】土壤是人類及其他生物賴以生存必不可少的環境要素，其能承擔環境中大約90%的污染物。Hg是土壤中主要的重金屬污染物之一，污染環境的同時也嚴重威脅人類健康，Hg對人體的傷害大多是農作物從土壤吸收經食物鏈傳遞導致[1-5]。因此，進行土壤汞污染治理修復研究對土壤的可持續發展能力和我國的糧食安全具有重要意義。【前人研究進展】世界上治理修復土壤汞污染主要采用農業工程技術[6]、植物修復技術[7]和物理化學修復技術[8]。農業工程技術和物理化學修復技術受一定的技術條件限制，適合局部區域治理，植物修復技術是通過植物將土壤中Hg2+固定、轉移、提取達到減輕污染的目的[9]，植物修復技術已逐漸成熟，具有效率高、低成本、操作簡單，不易造成二次污染的特點，在治理土壤污染的同時還具有美化環境、凈化空氣的作用，成為重金屬污染土壤修復的研究熱點。大多數草本植物有一定的抗Hg能力，可以在一定程度重金屬污染的土壤環境中生存[10-11]。已有研究表明，一些草本植物對Hg有較高的富集能力，而且能通過不斷刈割這些草本植物最終將將土壤中的Hg2+富集后再轉移出土壤，達到既能修復土壤、又能減少農產品污染和重金屬在食物鏈中擴散的目的[12-13]。【研究切入點】目前關于草坪草、牧草對土壤汞污染修復的相關研究比較少，因此，選取前期耐汞發芽試驗中篩選出的一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.)盛宴(cv.Feast)、紫羊茅(FestucarubraL.)派尼(cv.Pernille)和傳奇(cv.Legend)以及紫花苜蓿(MedicagosativaL.)金皇后(cv.Golden empress)4個草坪草、牧草品種進行不同濃度汞脅迫土培試驗，探究汞脅迫處理下4個草坪草、牧草品種幼苗的生理反應特性及養分積累情況。【擬解決的關鍵問題】探明4個草坪草、牧草品種的抗汞脅迫能力，為土壤汞污染的治理提供植物修復材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試草種 一年生黑麥草盛宴、紫羊茅派尼和傳奇的種子均于2016年購自百綠集團，紫花苜蓿金皇后種子由甘肅農業大學教育部草業生態系統重點實驗室提供。所有供試種子凈度均>98%。

1.1.2 試驗土壤 試驗土壤采集于貴州省銅仁市萬山區的萬山汞礦區。1號土壤采集地距礦區約650 m，土壤為栽種玉米3a的黃壤土；2號土壤采集地距礦區約500 m，為種植玉米約2 a的黃壤復耕地；3號土壤采集地距排礦口20 m，土壤以礦渣為主，混合荒地土，栽種玉米約2 a； 4號土壤采集地距排礦口30 m，荒地，以汞礦渣為主，生長少量雜草；非汞礦區土壤(CK)采集于貴州師范學院印山林地。采集各土樣均為表層0～20 cm的非根際土壤，去雜質后120℃烘干1.5 h，碾碎過1 mm篩備用，其初始理化性質見表1。

表1 供試土壤的基本理化性質

1.2 方法

采用土培盆栽試驗，每個土樣為1個處理，共5個處理，5次重復。將采回的5個土壤樣本分別按150 g/盆土裝入直徑6 cm、高8 cm的小花盆中，每個花盆均勻散播100粒種子，覆0.5 cm土壤，澆透水。第15天統計其成活數，觀察外傷癥狀。30 d后取樣測定各項生長指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葉綠素含量 用分光光度計法測定[14]。稱取0.20 g新鮮葉片剪碎，加10 mL95%的乙醇避光浸泡至葉片呈白色。以95%乙醇作空白對照，分別在波長665 nm、649 nm處測定葉片的吸光度，計算葉片葉綠素含量。

Ca=13.95×A665-6.88×A649

Cb=24.96×A649-7.32×A665

CT=Ca+Cb

式中，Ca、Cb、CT分別為葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素濃度，A665、A649分別為色素提取液在波長665 nm、649 nm處的吸光值。

1.3.2 葉綠素熒光 植株葉片暗適應20 min后，用(MINI-PAM-II)型便攜式調制熒光分析儀測定植物葉片PSII的原初光化學效率(Fv/Fm)。

1.3.3 丙二醛和可溶性糖含量 以硫代巴比妥酸法[15]測定葉片MDA含量和可溶性糖含量。取植物葉片1.0 g，加10%三氯乙酸(TCA) 2 mL和少量石英砂研磨，繼續加入8 mL TCA充分研磨，勻漿液4 000 r/min離心10 min，取上清液低溫保存待測。吸取2 mL提取液(對照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6%TBA液混勻，試管加塞并沸水浴15 min，冷卻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液測定532 nm和450 nm處的吸光值。根據Lambert-Beer定律計算MDA和可溶性糖含量。

C1(μmol/L)=6.45×A532-0.56×A450

C2(μmol/L)=11.71×A450

式中，C1為MDA的濃度，C2為可溶性糖的濃度，A450、A532分別為450 nm、532 nm波長下的吸光值。

1.3.4 根際土壤銨態氮、有效磷、速效鉀含量 用毛刷將植株根系附著的根際土刷下并于80℃烘干至恒重，稱取2 g待測土，用HM-TYA型(山東恒美)土壤養分檢測儀測定銨態氮、有效磷和速效鉀含量。

1.3.5 植株速效氮、速效磷及速效鉀含量 取新鮮植株樣品1.0 g，洗凈擦干，加石英砂研磨后用提取液稀釋，用HM-TYA型土壤植株養分檢測儀測定植株的速效氮、速效磷及速效鉀含量。

1.3.6 根系活力 用TTC法測定根系活力[16]。TTC標準曲線的制作：取0.4% TTC溶液0.2 mL放入10 mL量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻顯色后再用乙酸乙酯定容至刻度搖勻后，分別取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度即得到反應產物25 μg、50 μg、100 μg、150 μg、200 μg的標準比色系列，對照空白，在485 nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線。

稱取根尖樣品0.5 g放入10 mL燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒在溶液內，在37℃下暗保溫13 h后，加入1 mol/L硫酸2 mL停止反應；同時作空白對照，先加硫酸，再加根樣，其他操作同上。

把根取出吸干水分后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂于研缽內磨碎，以提出三苯基甲臜(TTF)。

1.4 數據分析

利用Excel 2007對原始數據進行整理及制圖，用SPSS 13.0對試驗數據進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 葉綠素含量

由圖1可見，隨著Hg2+濃度升高，各品種的葉綠素含量變化各異。處理1盛宴的葉綠素含量較對照無顯著變化，金皇后和派尼顯著上升，傳奇顯著下降。處理2傳奇的葉綠素含量較對照無顯著變化，盛宴、金皇后和派尼均呈顯著升高，增幅分別為36.66%、12.05%和15.68%。處理3除派尼的葉綠素含量較對照顯著降低外，其他品種變化不大。處理4盛宴、傳奇和派尼的葉綠素含量較對照均顯著下降，降幅分別為19.60%、22.59%和27.17%；金皇后則顯著升高，增幅為14.52%。4種土壤中，金皇后的葉綠素含量變化較平緩。

圖1 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的葉綠素含量

2.2 PS II原初光能轉化效率(Fv/Fm)

由圖2可見，隨著Hg2+濃度升高，盛宴、金皇后和傳奇的PS II原初光能轉化效率無顯著變化，派尼則顯著升高；其中，盛宴和傳奇均呈先升后降再升趨勢，金皇后呈先降后升再降趨勢。

2.3 丙二醛(MDA)含量

由圖3可見，隨著Hg2+濃度升高，盛宴的MDA含量呈先降后升再降趨勢，與對照相比，處理1、處理3和處理4降幅分別為17.01%、39.46%和27.56%。金皇后的MDA含量隨Hg2+濃度升高呈明顯升高后下降的趨勢，與對照相比，處理1的MDA含量增幅為29.59%，處理2、處理3和處理4降幅分別為23.43%、15.76%和19.89%。傳奇的MDA含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升再降趨勢，處理1、處理2、處理3和處理4降幅分別達66.27%、79.37%、65.31%和88.68%。派尼的MDA含量隨Hg2+濃度升高而明顯升高，處理1、處理3和處理4的MDA含量較對照增幅分別達29.76%、40.42%和87.24%，處理2變化不大。

圖3 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的丙二醛含量

圖2 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的PS II原初光能轉化效率

2.4 可溶性糖含量

由圖4可見，盛宴的可溶性糖含量隨Hg2+濃度升高整體呈降低趨勢；金皇后呈先顯著上升再顯著下降后基本穩定的趨勢，在Hg2+濃度最高的處理4可溶性糖含量與對照接近；傳奇呈先降后升再降趨勢，處理1和處理2土壤的可溶性糖含量降幅較大，分別為47.05%和47.31%；派尼呈顯著下降后略升趨勢，處理1～4均顯著低于對照。

圖4 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的可溶性糖含量

2.5 根系活力

由圖5可見，隨著土壤Hg2+濃度升高，盛宴和金皇后的根系活力均呈先下降再緩慢上升趨勢，處理1～4顯著低于對照，金皇后的根系活力較對照降幅為34.41%～75.49%。傳奇的根系活力處理1和處理2與對照間無顯著變化，處理3顯著上升，處理4顯著降低，處理1～4均低于對照。派尼的根系活力隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，含汞土壤中的根系活力顯著低于無汞土壤，降幅為30.46%～88.21%。

圖5 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的根系活力

2.6 速效氮含量

由圖6可見，盛宴植株速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先下降再快速升高趨勢，處理1、處理2和處理3的速效氮含量較對照的降幅分別為25.56%、13.37%和11.38%，處理4的增幅則達26.81%。金皇后的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降趨勢，增幅分別為46.92%、92.34%、58.67%、70.65%，差異顯著。傳奇的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降趨勢。派尼的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降再升趨勢，處理1、處理2、處理4較對照的增幅分別為49.45%、36.05%和12.27%，5個處理間差異均達顯著水平。

圖6 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的速效氮含量

2.7 速效磷含量

由圖7可見，盛宴的速效磷含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，各處理間速效磷含量差異均達顯著水平，處理1、處理2的速效磷含量較對照的降幅分別為23.71%和12.64%，處理3、處理4的速效磷含量較對照的增幅分別為23.63%和17.60%。金皇后的速效磷含量隨Hg2+濃度升高呈持續升高的趨勢，除處理1和處理3間的速效磷含量差異不顯著外，其余各處理間差異均達顯著水平，處理1、處理2、處理3、處理4的速效磷含量較對照的增幅分別達191.36%、84.67%、178.90%和156.84%。傳奇的速效磷含量隨Hg2+濃度的升高呈先降后升再降的趨勢，對照和3號土壤的速效磷含量與其他其他處理的差異均達顯著水平，處理1、處理2、處理4的速效磷含量較對照的降幅分別為66.98%、70.74%和63.36%。派尼的速效磷含量各處理間差異不顯著。

圖7 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的速效氮含量

2.8 速效鉀含量

由圖8可見，盛宴的速效鉀含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，對照和處理1間差異不顯著，與其他處理間差異均顯著，處理1、處理2和處理3的速效鉀含量較對照的降幅分別為3.72%、48.37%和23.91%，處理4較對照增加3.66%。金皇后的速效鉀含量隨Hg2+濃度升高呈持續升高的趨勢，除處理3和處理4間差異不顯著外，其他處理間差異均達顯著水平，處理1、處理2、處理3和處理4的速效鉀含量較對照的增幅分別為28.93%、10.65%、176.27%和171.13%。傳奇的速效鉀含量隨Hg2+濃度的升高呈先降后升再降的趨勢，各處理間差異均達顯著水平。派尼的速效鉀含量隨著Hg2+濃度升高僅處理2升高外，其余處理均明顯下降，處理3、處理4的速效鉀含量較對照的降幅分別為38.22%和71.39%。

圖8 不同濃度Hg2+脅迫下4個品種的速效鉀含量

3 討論

葉綠素熒光參數中的Fv/Fm值常用于衡量植物在逆境脅迫下葉片光合系統II原初光能轉化效率[17-18]，Hg脅迫對不同草坪草、牧草的Fv/Fm值影響可能并不一致。低濃度Hg能促進盛宴、傳奇、派尼的葉片光合系統II原初光能轉化效率。而金皇后在不同Hg處理下的葉片Fv/Fm值顯著低于非汞礦區土壤，可能是Hg脅迫使金皇后光系統PS II反應中心受損，光合作用的原初反應產生抑制，使光合電子傳遞受阻，不利于金皇后葉片把捕獲的光能轉變為化學能[17-18]。其次，光合作用與葉綠素含量也有密切關系，金皇后在各處理中的葉綠素值基本高于CK，盛宴與CK無明顯差異，傳奇和派尼則低于CK。說明葉綠素含量受Hg脅迫影響程度依次為金皇后<盛宴<傳奇<派尼。

植物器官在逆境下或衰老時，常會發生膜脂過氧化作用，從而產生MDA，因此常將MDA含量作為脂質過氧化指標，用以表示細胞膜過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[19-20]。盛宴、金皇后、傳奇的MDA含量在非汞礦區土壤達到最大值，可能是由于土質問題，CK的土壤取自貴州師范學院寶珠山上松樹林周邊，取土周圍無太多草本植物生長，由此推斷，土壤中可能含有某種松樹分泌的化感物質，致使試驗草植株體的MDA含量升高。而派尼的MDA含量在Hg濃度最高的土壤中最高，說明Hg2+比松樹分泌的化感物質對派尼的細胞膜影響程度更大，即盛宴、金皇后、傳奇比派尼更耐受Hg2+的脅迫。可溶性糖含量的升高是植物面對脅迫環境時的應激反應[21]，派尼和傳奇隨著Hg濃度的升高，其可溶性糖含量下降明顯，盛宴的可溶性糖含量則與非汞礦區土壤無明顯區別，金皇后的可溶性糖含量在最低濃度處理下呈升高現象，后趨平緩狀態，說明面對脅迫環境，金皇后比其他3種草的應激反應能力更強，其余依次是盛宴、傳奇和派尼。

根系活力(四氮唑還原強度)是根的重要生理指標，活力越高吸收水分和營養的能力越強，當受逆境如重金屬、鹽堿、干旱等脅迫時植物根系活力降低[22-23]。盛宴、金皇后、傳奇的根系活力隨著Hg脅迫濃度升高而先下降后上升，但根系活力均明顯低于對照，特別是中低濃度Hg脅迫下根系活力下降，而高濃度脅迫下反而升高，說明經過低濃度抗汞脅迫鍛煉，根系產生一定耐抗能力，根系活力有所提高，以抵抗更嚴苛的脅迫。而派尼的根系活力較CK下降明顯，同時也說明其抗汞脅迫能力較弱。

氮、磷、鉀 為植物必須的三大營養元素，對植物的生長發育具有非常重要的作用，Hg2+通過與養分競爭植物根系的吸收部位，干擾植物對養分的吸收和利用[24-26]。研究表明，Hg2+對4個草品種N、P、K的積累影響較大，盛宴、金皇后的氮、磷、鉀積累量均隨Hg2+濃度的升高先降后升，且品種間存在差異，2品種的氮、磷、鉀積累量在高濃度Hg脅迫下反而升高，其原因可能是基質中高濃度的Hg2+提高了氮、磷、鉀的有效態含量，導致植物對氮、磷、鉀的吸收含量增加。而傳奇和派尼的氮、磷、鉀積累量持續下降，原因可能是Hg2+降低了氮、磷、鉀的有效態含量。金皇后和盛宴在高濃度Hg脅迫下氮、磷、鉀積累量的升高進一步印證了其較強的抗汞脅迫能力。

4 結論

在Hg2+0～181 mg/kg處理范圍內，金皇后和盛宴的耐Hg脅迫能力較好，更適宜在低Hg污染地區推廣種植；傳奇耐汞能力次之，派尼最弱，不適宜在汞污染區推廣種植。由于試驗草種僅為4種，只能為耐Hg脅迫草坪草、牧草品種的選育、栽培策略優化和Hg污染土壤生物修復等研究提供一定的參考。對選育出高富集Hg能力的草品種還需進行大量的試驗。