熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測乙型肝炎病毒的臨床價值

李秀萍，何彩云，黃澤棋，魏海清

（1.佛山市人民政府機(jī)關(guān)門診部檢驗(yàn)科；2.佛山市人民政府機(jī)關(guān)門診部內(nèi)科； 3.佛山市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528099）

乙型肝炎是指乙型肝炎病毒（HBV）感染，病程在半年以上或發(fā)病日期不明，伴有慢性肝炎表現(xiàn)的患者，屬于臨床常見的傳染性疾病，其具有較高的患病率和感染率，隨著病情進(jìn)展，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肝硬化、原發(fā)性肝癌等病變。因此，臨床及時診斷乙型肝炎并準(zhǔn)確判定病情嚴(yán)重程度具有重要的意義。實(shí)施酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行檢測具有操作簡單、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，但該方法只能反映患者對HBV病毒的免疫應(yīng)答狀態(tài)，而不能準(zhǔn)確反映機(jī)體HBV感染復(fù)制情況和傳染危險性[1]。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對HBV患者基因的檢測具有重要的應(yīng)用價值，其可直接、動態(tài)地反映HBV病毒的復(fù)制狀態(tài)及傳染危險性，從而判斷患者的疾病狀況[2]。本研究旨在探討熒光定量PCR技術(shù)檢測慢性HBV的臨床價值，以期為患者臨床治療提供參考價值，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月至2020年12月在佛山市第二人民醫(yī)院治療的192例乙型肝炎患者的臨床資料，其中男性121例，女性71例；年齡25~67歲，平 均（44.61±4.82）歲；體 質(zhì) 量45~72 kg，平 均（66.63±3.18）kg。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[3]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；無腎、心、肺等重要臟器功能障礙者；無精神系統(tǒng)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：凝血功能障礙者；患有惡性腫瘤疾病者；患有免疫系統(tǒng)和嚴(yán)重內(nèi)科疾病者。本研究經(jīng)佛山市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 方法

1.2.1 HBV免疫學(xué)檢測 患者首先采用ELISA法進(jìn)行乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物 -M（HBV-M）的定性檢測。抽取患者清晨空腹靜脈血5 mL，于4 ℃條件下放置2 h后，分離血清，檢測乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（HbsAb）、乙型肝炎e抗原（HbeAg）、乙型肝炎e抗體（HbeAb）、乙型肝炎表面核心抗體（HbcAb），嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作與結(jié)果評定。

1.2.2 HBV-DNA定量測定 采用PCR技術(shù)對HBV- 脫氧核糖核苷酸（DNA）水平進(jìn)行檢測，血樣采集方法同1.2.1，置于真空惰性分離膠促凝管中，進(jìn)行離心操作（3 000 r/min，10 min）制備血漿標(biāo)本，采用熒光定量分析儀進(jìn)行熒光定量PCR測定乙型肝炎病毒HBV-DNA 水平。所有操作均由同一位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo) ①分析ELISA法檢測HBV-M結(jié)果。②分析熒光定量PCR技術(shù)檢測HBV-DNA結(jié)果。③比較不同病情程度患者HBV-DNA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[ 例(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（±s）表示，行t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測HBV-M結(jié)果 本研究192例乙型肝炎患者血液標(biāo)本中，HBV-M的定性檢測有8種模式，其中HBsAg+HbeAg+HbcAb、HBsAg+HbsAb+HbcAb模式陽性檢出率分別為25.52%、35.42%，均高于其他模式陽性檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表1。

表1 ELISA檢測HBV-M結(jié)果

2.2 熒光定量PCR檢測HBV-DNA結(jié)果 HBsAg+HbeAg+ HbcAb、HBsAg+HbsAb+HbcAb模式的HBV-DNA 陽性檢出率高于其他模式的陽檢出性率，HBsAg+ HbeAg+HbcAb、HBsAg+HbsAb+HbcAb模式的HBVDNA表達(dá)水平高于其他模式的HBV-DNA表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表2。

表2 PCR檢測HBV-DNA結(jié)果

2.3 不同病情程度患者HBV-DNA水平 重度乙型肝炎患者HBV-DNA水平高于輕、中度患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表3。

表3 不同病情程度患者HBV-DNA水平比較 (±s,×104copies/mL)

表3 不同病情程度患者HBV-DNA水平比較 (±s,×104copies/mL)

注：與輕度組比，△P<0.05；與中度組比，▲P<0.05。 HBV-DNA：乙型肝炎病毒 - 脫氧核糖核苷酸。

病情 例數(shù) HBV-DNA輕度 51 23.60±4.40中度 98 147.85±20.05△重度 43 254.80±27.01△▲F值 1 691.102 P值 <0.05

3 討論

乙型肝炎屬于臨床常見的一種感染性疾病，其具有較強(qiáng)的傳染力，當(dāng)機(jī)體感染HBV后可引起免疫性病理損害，且肝細(xì)胞的受損程度與機(jī)體免疫應(yīng)答密切相關(guān)。乙型肝炎患者早期癥狀較為隱匿，大部分患者被確診時已處于中晚期，因此錯過了最佳的治療時機(jī)，隨著疾病進(jìn)展，可引發(fā)肝硬化、肝癌等，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。因此，臨床早期診斷并及時給予有效的治療具有重要的意義。

目前臨床主要采用的檢測方法有ELISA法、熒光定量PCR技術(shù)等，ELISA法具有操作簡單、價格低廉、靈敏度高等特點(diǎn)，但由于該檢測方法只能通過反映患者對HBV感染免疫應(yīng)答狀態(tài)，從而間接地對HBV進(jìn)行診斷，無法對HBV感染程度進(jìn)行測定，故存在一定的局限性[4]。熒光定量PCR技術(shù)能夠反映HBV的復(fù)制情況和傳染性，能夠?qū)σ腋尾《綝NA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢驗(yàn)，避免出現(xiàn)漏診，該技術(shù)的應(yīng)用提高了對HBV的檢測準(zhǔn)確性，從而為臨床病情診斷提供重要依據(jù)[5-6]。

HBV-M主要包括HBsAg、HbsAb、HbeAg等，其中HBsAg+HbeAg+HbcAb又被稱為“大三陽”，表明機(jī)體存在HBV感染且病毒處于活躍期，具有病毒數(shù)量多且傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)；HBsAg+HbsAb+HbcAb屬于“小三陽”，HBsAg+HbeAg又被稱為“大二陽”，表明機(jī)體存在HBV感染，但需根據(jù)肝功能損傷情況來進(jìn)行相應(yīng)的治療[7-8]。本研究結(jié)果顯示，ELISA法檢測HBV-M結(jié)果中，HBsAg+HbeAg+HbcAb、HBsAg+HbsAb+ HbcAb模式陽性檢出率較高，同時熒光定量PCR技術(shù)檢測HBV-DNA結(jié)果中，HBsAg+HbeAg+HbcAb、HBsAg+HbsAb+HbcAb模式的HBV-DNA陽性檢出率較高，表明ELISA法和PCR技術(shù)均可準(zhǔn)確判斷患者是否處于HBV感染期。同時本研究結(jié)果顯示，HBsAg+ HbeAg模式的陽性率低于HBsAg+HbeAg+HbcAb，但HBV-DNA表達(dá)水平仍較高，表明該模式下患者仍存在HBV-DNA復(fù)制，因此臨床不能僅依靠血清學(xué)來判定結(jié)果，仍需通過檢測HBV-DNA對患者病情進(jìn)行監(jiān)測。相關(guān)研究顯示，HBV-DNA水平越高，則其復(fù)制能力也隨之增強(qiáng)，可加重對肝臟組織的損害，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭等，增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險[9]。本研究中，重度乙型肝炎患者HBV-DNA水平高于輕、中度患者，提示HBV-DNA水平與慢性乙肝患者的病情呈正相關(guān)。

綜上，相較于ELISA法，熒光定量PCR技術(shù)可定量反映病毒感染、復(fù)制情況，為早期診斷乙型肝炎、監(jiān)測病情歸轉(zhuǎn)提供重要依據(jù)。