藥品中金黃色葡萄球菌的定性檢測和質量控制

韓珍珍，文玉輝

(運城市綜合檢驗檢測中心，山西 運城 044000)

金黃色葡萄球菌隸屬葡萄球菌屬，是革蘭陽性菌的代表，廣泛存在于動物和人體內，是人類化膿性感染最常見的病原菌，對各種理化因素都有較高的抵抗力[1]，是藥品質量控制的重要指標之一[2]。為提高藥品中金黃色葡萄球菌的檢測能力，2020年本實驗室參加由中國食品藥品檢定研究院組織的藥品中金黃色葡萄球菌檢測能力的驗證，取得滿意結果。通過本次能力驗證，再次確認了實驗室分析檢測技術，為其他實驗室提供了參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

NIFDDC-PT-288金黃色葡萄球菌檢驗能力驗證樣品3份，每份樣品采用棕色西林瓶包裝，鋁蓋密封，每瓶量按10 g計，編號為121(代號1)、176(代號2)、372(代號3)，由上海市食品藥品檢驗所提供(中國食品藥品檢定研究院組織、上海市食品藥品檢驗所負責實施)。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 菌株及試劑

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]均購于中國醫學微生物菌種保存中心，使用前經全自動生化檢定儀進行生化確認。甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(北京三藥，批號：200828)，凍干兔血漿(陸橋，批號：200917)，革蘭氏染色液(陸橋，批號：200831)，陽性菌鑒定卡(GP)(法國生物梅里埃公司)等。

1.2.2 儀器

濁度儀(法國生物梅里埃公司)、VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)、BHC-1300Ⅱ生物安全柜(蘇凈集團)、生化培養箱(上海博迅)、OLYMPUS顯微鏡等。

1.3 實驗方法

能力驗證作業指導書要求收到樣品應盡快檢測，未檢測前放置在-20 ℃保存，并盡快檢測。檢測方法參照《中國藥典》2015版四部通則1106非無菌產品微生物限度檢查和控制菌檢查方法。

1.3.1 菌種及培養基質控

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌使用前經全自動生化檢定儀進行生化確認。根據2015版藥典對甘露醇氯化鈉瓊脂培養基進行培養基適用性檢查，此培養基的促生長能力+指示特性(實驗菌株：金黃色葡萄球菌)及抑制能力實驗(實驗菌株：大腸埃希菌)均符合要求。

1.3.2 前處理及劃線接種

在生物安全柜內打開裝有樣品的西林瓶，向瓶內加入5 mL滅菌水，將樣品完全溶解并混勻后，轉移至90 mL胰酪大豆胨液體培養基中，再用滅菌水潤洗西林瓶，總潤洗體積為5 mL，將上述全部潤洗液轉移至胰酪大豆胨液體培養基中。以此方法分別處理3份樣品，注意防止交叉污染(紫外燈殺菌30 min后操作下一個樣品)，同時做陽性對照(加入金黃色葡萄球菌)和陰性對照(加入大腸埃希菌)，以上6瓶分別混勻后33 ℃培養18 h，將上述培養物分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，33 ℃培養48 h。

1.3.3 菌種鑒定

分別挑取甘露醇氯化鈉瓊脂平板上的可疑菌落A和B(來源1)、C和D(來源2)、E(來源3)共五種，進行觸酶實驗、革蘭氏染色和血漿凝固酶試驗，然后再進行VITEK2 Compact生化鑒定。

2 結果與分析

挑取甘露醇氯化鈉瓊脂平板上的疑似菌落，結合菌落形態特征(見圖1)、觸酶實驗、革蘭染色(見圖2)、血漿凝固酶(見圖3和圖4)及VITEK2 compact生化鑒定結果，與陽性對照菌進行比對，確定1和3都未檢出金黃色葡萄球菌，2檢出金黃色葡萄球菌，詳見表1。甘露醇氯化鈉瓊脂平板主要原理是金黃色葡萄球菌能在高鹽平板上生長，發酵甘露醇產酸，菌落發黃且光滑濕潤、邊緣整齊無皺褶，所以排除菌落B和菌落C。觸酶試驗鑒定菌株是否產生過氧化氫酶。血漿凝固酶試驗鑒定特點是血漿凝固，呈胨狀傾斜不流動，據此排除A和E。

3 討 論

本次中檢院組織的藥品中金黃色葡萄球菌檢驗能力驗證結果為滿意，我們主要做了以下準備：第一，在能力驗證前對購買菌種及培養基進行質控且設置陽性和陰性對照，方便出現問題時查找原因[3]，再者進行預實驗對所涉及到的標準菌株、試劑及培養基、儀器設備進行確認，統籌安排好人員、試驗方法及步驟，考慮試驗進行過程中可能出現的意外狀況并做好相關的實驗室預案，可以保證結果準確可靠。第二，實驗操作過程對檢驗結果影響很大，操作過程的交叉污染和典型菌落的識別也易導致檢驗人員對結果的判斷產生偏差[4]。本次能力驗證樣品數量為3組，分組操作，每次操作間均紫外殺菌30 min以上，避免樣品的混淆和交叉污染，同時在使用標準菌株做質控時，先操作陰性對照，再處理待測樣品，最后操作標準菌株。此外可疑菌落的確定是關鍵，要參照陽性菌株培養基上的形態、顏色、質地確定可疑菌落后再挑取。第三，血漿凝固酶實驗應使用新鮮的培養物。放置時間過長的培養物血漿凝固酶活性會降低，一些菌株可產生使血漿凝集物解集的葡激酶和纖溶酶，會使已經凝固的血漿重新溶解，如不及時觀察會產生假陰性結果[5]。此次試驗腦心浸出液肉湯(BHI)為新鮮配制，接菌培養時間為18 h，血漿凝固酶實驗每隔30 min觀察1次，血漿凝固酶陽性菌株均在1 h后全部凝固，保證了時效。盛成蘭等[6]指出部分金黃色葡萄球菌凝固酶產生量低，短時間內不易肉眼觀察，易造成實驗失敗，故此試驗在血漿凝固酶陽性的基礎上又用全自動生化儀對結果進一步確認。第四，實驗結束后，整理數據也是至關重要的環節，質控人員要核對樣品編號，從小到大有序排列，避免樣品編號混淆。

圖1 甘露醇氯化鈉瓊脂平板(金黃色葡萄球菌)

圖2 放大1000×的金黃色葡萄球菌

圖3 血漿凝固酶試驗

圖4 血漿凝固酶試驗(凝固不流動)

表1 樣品在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上的菌落特征及生化鑒定結果表