益氣溫陽法聯合順鉑對荷瘤小鼠調節性T細胞的影響

張召楊 孫增濤 王霖

摘要 目的：研究益氣溫陽法聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠調節性T（T Regulatory，Treg）細胞的影響。方法：建立40只近交系C57BL/6純系雄性小鼠Lewis肺癌細胞皮下移植瘤模型后，將40只造模后的小鼠隨機分為模型組、中藥組、順鉑組及聯合用藥組，每組10只，單籠飼養。模型組以0.4 mL生理鹽水連續灌胃12 d;中藥組以0.4 mL中藥液連續灌胃12 d（20 g生藥/kg）;順鉑組以0.2 mL順鉑溶液腹腔注射，分別在第1天、第3天、第5天腹腔注射順鉑溶液（4 mg順鉑/kg）;聯合用藥組以0.4 mL中藥液連續灌胃12 d（20 g生藥/kg），在第1天、第3天、第5天腹腔注射順鉑溶液0.2 mL（4 mg順鉑/kg）。給予藥物干預12 d后，用流式細胞術檢測各組小鼠脾臟組織Treg細胞的比例。結果：流式細胞術結果表明，益氣溫陽法治療可顯著降低Lewis肺癌小鼠脾臟組織Treg細胞，與模型組比較，中藥組、順鉑組和聯合用藥組小鼠脾臟組織內CD4+CD25+Treg細胞比例與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例均顯著降低（P<0.05）。結論：益氣溫陽法通過降低Treg細胞的水平增強機體的抗腫瘤免疫應答而發揮抑瘤作用。

關鍵詞 肺癌;益氣溫陽法;調節性T細胞;自身免疫;轉錄因子Foxp3;CD4+CD25+Treg細胞;D4+CD25+Foxp3+Treg細胞

Abstract Objective：To study the effects of Yiqi Wenyang method combined with cisplatin on T regulatory cell （Treg） of Lewis lung cancer mice.Methods：After 40 inbred C57BL/6 male mice with Lewis lung cancer cell transplanted subcutaneously were established，They were randomly divided into model group，traditional Chinese medicine group，cisplatin group and combined drug group，10 in each group，fed in single cage.The model group was given 0.4 mL saline for 12 days;In the traditional Chinese medicine group，0.4 mL of traditional Chinese medicine solution was infused into the stomach for 12 days （20 g crude drug/kg）;In cisplatin group，0.2 mL cisplatin solution was intraperitoneally injected，and cisplatin solution （4 mg cisplatin/kg） was intraperitoneally injected on the first day，the third day and the fifth day respectively;In the combined group，0.4 mL traditional Chinese medicine solution was infused into the stomach for 12 days （20 g crude drug/kg），and 0.2 mL cisplatin solution （4 mg cisplatin/kg） was injected intraperitoneally on the first day，the third day and the fifth day.After 12 days of drug intervention，the proportion of Treg cells in spleen tissue of mice in each group was detected by flow cytometry.Results：the results of flow cytometry showed that the treatment of Yiqi Wenyang method could significantly reduce the spleen Treg cells of Lewis lung cancer mice.Compared with the model group，the number of the proportion of CD4+CD25+ Treg cells and the proportion of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in spleen tissue of mice in the traditional Chinese medicine group，cisplatin group and combination group were significantly reduced （P<0.05）.Conclusion：the method of Supplementing Qi and warming yang can inhibit tumor by reducing the level of Treg cells and enhancing the anti-tumor immune response.

Keywords Lung cancer; Yiqi Wenyang method; Regulatory T cells; Autoimmunity; Transcription factor Foxp3; CD4+CD25+ Treg cells; D4+CD25+Foxp3+ Treg cells

中圖分類號：R273;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.010

肺癌屬惡性腫瘤之一，并且其發生率與死亡率在惡性腫瘤排名第一，嚴重威脅人類生命健康，成為我們亟待解決的問題[1]。它的發生、發展與機體自身免疫機制密不可分。調節性T細胞（Treg細胞）是體內調節自身免疫的一類T細胞亞群，具有抑制免疫細胞介導的免疫反應及組織微環境中特定非免疫細胞的代謝及增殖等生理功能，并且精確調控機體免疫應答水平以維持機體的免疫耐受狀態[2]。其中CD4+CD25+調節性T細胞雖然僅占CD4+T細胞的5%～10%，但其作為天然的調節細胞，在建立自身免疫耐受及免疫平衡等方面起著重要作用，是免疫系統不可缺少的重要組成部分，也對多種非自身組織的抗原發生免疫反應[3]。轉錄因子Foxp3是Treg細胞的特異性核轉錄因子，也是CD4+CD25+Treg細胞發育和功能維持的主要調節基因[4]。CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞為主的抑制性T細胞在肺癌免疫抑制中占主導地位[5]。單純的化療藥物療法療效佳，但易產生耐藥性，需要聯合中醫治療。本研究通過檢測Lewis肺癌小鼠脾臟組織中Treg細胞的數量探討益氣溫陽法治療小鼠Lewis肺癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取近交系C57BL/6純系小鼠40只，雄性，體質量（18.0±2.0）g，購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（津）2019-0002。動物級別：清潔級別，培養在室溫（25±2）℃室內，每日日照時間達到12 h，室內通風良好，濕度40%～60%，給予足量飼料及自由飲水。實驗操作符合動物福利倫理要求（倫理審批號：IRM-DWLL-2019140）。

1.1.2 藥物 中藥復方益氣溫陽方由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿、黨參、莪術、雞內金、桔梗、甘草等10味中藥組成，方藥選取及制備由天津中醫藥大學第二附屬醫院藥房將藥物制成顆粒劑，用蒸餾水配制成含生藥0.1 g/mL的藥液置于4 ℃冰箱中保存。順鉑注射液（齊魯制藥有限公司，生產批號：8K029A89）10 mg/支，用生理鹽水配制含順鉑0.4 mg/mL的藥液供實驗用。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（HyClone，美國，批號：AF29498419），1640培養基（Gibco，美國，批號：8120386），FITC標記的抗小鼠CD4MsAb（美國BD，美國，批號：561828），BB700標記的抗小鼠CD25MsAb（美國BD，美國，批號：566499），APC標記的抗小鼠Foxp3MsAb（美國BD，美國，批號：563486），Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit（MultiSciences，批號：70-IC001-100），CO2細胞培養箱（日本Sanyo公司，日本，型號：MCO-175），光學顯微鏡（日本Nikon，日本，型號：ECLIPSETS100），流式細胞分析儀（美國BD，美國，型號：Accuri C6），離心機（北京新時代北利醫療器械有限公司，型號：GTR16-2）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：C57BL/6小鼠接種后，并隨機分為4組，每組10只，分別為模型組、順鉑組、中藥組與聯合用藥組。2）細胞培養：小鼠Lewis肺癌瘤株購于中國科學院上海生命科學研究院，置于液氮罐中凍存。細胞復蘇時取小鼠Lewis肺癌瘤株于37 ℃水浴融化，加入RPMI1640完全培養液（90% 1640培養液+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素），在37 ℃，5% CO2培養箱中常規培養，次日換液，待融化80%左右時用胰酶消化傳代，3 d傳代1次。3）模型制備：將培養后的Lewis細胞用胰蛋白酶消化，傳代后，待細胞達到所需量時，顯微鏡下計數，調整細胞約1×107個/mL。每只小鼠接種前，充分搖勻瘤細胞懸液，取瘤細胞懸液0.2 mL于小鼠右腋窩皮下接種，在30 min內接種完畢。以接種后第2～9天于小鼠右腋皮下觸摸到腫瘤結節（腫瘤平均直徑達到約5 mm）為建模成功，將動物隨機分組開始給藥。

1.2.2 給藥方法 模型組以0.4 mL生理鹽水連續灌胃12 d;順鉑組于第1、3、5天以0.2 mL/只腹腔注射順鉑注射液（4 mg順鉑/kg）;中藥組連續灌胃12 d灌胃益氣溫陽方（20 g生藥/kg）0.4 mL/只;聯合用藥組：連續灌胃12 d灌胃益氣溫陽方（20 g生藥/kg）0.4 mL/只，同時第1、3、5天腹腔注射順鉑注射液（4 mg順鉑/kg）0.2 mL/只。取材前1 d禁食，將各組小鼠頸椎脫臼處死后無菌取其脾臟組織。

1.2.3 檢測指標與方法 通過流式細胞分析儀檢測脾臟CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例。將小鼠頸椎脫臼處死，收取脾臟，制備細胞懸液;收集細胞懸液，過濾至離心管中;于4 ℃，加入磷酸緩鹽沖液（PBS）洗滌1次，1 000 r/min，離心半徑9 cm，離心5 min，用染色緩沖液調整細胞為1×107/mL。取100 μL細胞懸液，加入CD4抗體和CD25抗體，輕彈混勻。避光，4 ℃，30 min。加入2 mL紅細胞裂解液，裂解5 min。然后加入2倍以上體積的PBS，終止裂解。4 ℃，1 000 r/min，離心半徑9 cm，離心5 min。用流式染色液洗，室溫1 000 r/min，離心半徑9 cm，離心5 min，重復2遍。最后1次離心后，完全棄上清。加1 mL Foxp3固定/滲透液工作液（固定/滲透濃縮液和固定/滲透稀釋液以1∶3的比例混合），渦旋固定細胞。4 ℃避光孵育60 min。每管加2 mL 1×滲透緩沖液。室溫，1 000 r/min，離心半徑9 cm，離心5 min，棄上清。加100 μL滲透緩沖液1×重懸細胞后，加入Foxp3抗體，室溫避光孵育30 min。2 mL 1×滲透緩沖液洗1次，室溫，1 000 r/min，離心半徑9 cm，離心5 min，棄上清。適量流式染色液重懸，上機檢測，用Flowjo獲取并分析數據，分別觀察CD4+細胞數、CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞之間的比例關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時選用LSD法，方差不齊時選Dunnett-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組小鼠CD4+CD25+Treg與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例比較，單因素方差分析結果顯示：與模型組比較，中藥組、順鉑組和聯合用藥組小鼠CD4+CD25+Treg細胞比例與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例均顯著降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）;與順鉑組比較，聯合用藥組CD4+CD25+Treg細胞比例顯著下降，差異均有統計學意義（均P<0.05），中藥組CD4+CD25+Treg細胞比例差異無統計學意義;與順鉑組比較，聯合用藥組與中藥組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例均顯著降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表1，圖1。

3 討論

肺癌的發生、發展、轉移及預后與免疫逃逸機制有很強的相關性。機體免疫系統可以識別清除惡性細胞，而腫瘤細胞可以通過Tregs逃避免疫識別和免疫監視，導致腫瘤免疫耐受[6]，從而促進腫瘤的發展。肺癌在中醫學方面歸屬于學“肺積”“喘息”“胸痛”“咳嗽”“咯血”等范疇，中醫認為肺癌多是因虛致病，患者機體正氣虛，亦指機體免疫功能低下，無力抗邪，邪氣日益亢盛，腫瘤逐漸增大、轉移。中醫學強調整體觀念，基本治療原則是扶正祛邪，通過中藥一方面增強機體免疫能力[7-8]，抑制腫瘤生長，減輕化療的不良反應，另一方面提高免疫因子的免疫識別和免疫監視能力，減少免疫逃逸。

調節性T細胞具有維持機體免疫耐受的功能，在機體免疫系統中發揮著重要的免疫保護功能，起著維持機體免疫功能穩定的重要作用，與腫瘤免疫相關[9]。在此方面，Treg細胞是一群具有促腫瘤免疫耐受和免疫逃逸的負調節細胞亞群，且其在多種腫瘤中均表現明顯的負向調控作用[10]。腫瘤細胞可誘導機體產生Treg細胞，而Treg細胞在腫瘤微環境中進一步發揮免疫抑制作用。CD4+CD25+Treg細胞是效應性T細胞的重要組成成分，在免疫調節過程中發揮重要作用。研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞抑制抗腫瘤免疫應答，促進免疫逃逸進而促進多種腫瘤的發生發展，包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等[11]。周奕辰和王金巖[12]通過小鼠Lewis肺癌實驗發現CD4+CD25+Treg細胞可通過多種機制加速腫瘤進展。Fxop3表面分子是叉頭翼狀螺旋轉錄因子的總稱，特異性表達于Treg細胞上，是Treg細胞的一個特異性標志，Foxp3可以顯著抑制機體的免疫反應[13]。劉瑞敏等[14]研究發現腫瘤細胞中存在著高表達的Foxp3，而高表達Foxp3的肺癌細胞可能通過表達細胞因子改變局部生長的微環境，逃逸免疫監視，而促進腫瘤細胞的成瘤和生長。Foxp3不僅對CD4+CD25+Treg細胞的活化有影響，而且對Treg細胞的發育和抑制也起一定作用[15-16]。在胸腺、脾臟和淋巴結等淋巴器官及淋巴組織中的CD4+CD25+Treg細胞表面均能夠特異性表達。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞基因突變會導致Treg細胞發育和功能受損，發生免疫調節紊亂[17]。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞參與腫瘤局部的免疫反應，腫瘤微環境中Treg細胞數量增多，使得免疫調節網絡得到激活并抑制機體的抗腫瘤免疫應答，因而導致了腫瘤免疫逃逸，促進了腫瘤的局部侵襲和遠處轉移。

中醫在治療腫瘤方面有著其獨特的優勢，研究表明中藥及其有效成分通過下調Treg細胞的比例與活性、抑制Foxp3及相關的抗免疫細胞因子的分泌，調節細胞比例從而降低Treg細胞的免疫抑制作用，增強機體免疫應答，逆轉腫瘤免疫逃逸，增強機體抗腫瘤活性，抑制腫瘤生長，改善患者的生命質量，延長患者生存時間[18]。除對癌細胞的直接殺傷殺滅作用外，中藥還能通過抑制癌細胞增殖分化，緩解化療療法不良反應，抑制腫瘤發展轉移，降低多種西藥耐藥性和增強機體免疫功能等而發揮其抗腫瘤作用[19]。益氣溫陽法是孫增濤教授總結臨床經驗所得，方以黃芪補中氣、固表氣、升陽舉陷與黨參補益脾肺之氣，二者共為君藥，主以益氣補脾，臣以肉蓯蓉與淫羊藿溫陽益腎;君臣共濟，益氣溫陽，寓攻于補，增強機體免疫力;最后佐以莪術、雞內金、桔梗、甘草等藥，化瘀通滯，破血消癥，以達到消瘤之效，使機體補而不滯，攻而不破。綜合全方攻補兼施，機體得以生養。在現代藥理實驗中發現益氣溫陽類藥物均對腫瘤具有抑制作用。Zhang等[20]研究發現黃芪提取物黃芪甲苷能夠抑制Lewis小鼠體內肺癌細胞的生長與轉移，其作用是通過下調Treg細胞比例。現代藥理研究發現黨參具有抗腫瘤和提高機體免疫能力的作用[21-23]。范亞楠等[24]發現無論是生肉蓯蓉還是炮制后的肉蓯蓉均具有提高機體免疫的功能。相關藥理實驗亦證實淫羊藿醇提物可能通過提高免疫調節能力的作用對肺癌產生明顯的抑制作用[25]。

楊國良等[26]通過實驗觀察發現益氣養陰方可能通過降低腫瘤組織Foxp3 mRNA的表達，減少CD4+CD25+Treg細胞分化，進行改善細胞免疫抑制狀態，從而抑制腫瘤的生長，且聯合治療較單純化療、單純益氣養陰治療有更好的療效。梁啟軍等[27]發現益氣清毒法治療肺癌基礎方及其防癌茶抑瘤效果良好，其抗癌機制與增強殺傷性免疫細胞的免疫力和減輕CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞等免疫抑制細胞的免疫抑制有關。林穎等[28]動物實驗研究發現，使用補腎益肺解毒法中藥干預Lewis肺癌小鼠后，可顯著降低小鼠外周血和移植瘤CD4+CD25+Treg細胞、Foxp3的水平，表明中醫補腎益肺解毒法通過降低CD4+CD25+Treg細胞比例、下調Foxp3的表達水平，從而達到提高機體的抗腫瘤免疫應答作用，進而發揮抑瘤作用。

因此，研究CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在肺癌中的作用對防治肺癌的轉移、復發具有重要作用。本研究發現益氣溫陽中藥對Lewis肺癌小鼠進行干預后，采用流式細胞術檢測Lewis肺癌小鼠脾臟CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，小鼠脾臟中CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例明顯下降。與化療組比較，中藥方聯合化療運用時其降低各項指標作用更為顯著，差異有統計學意義;與化療藥比較，中藥組可以明顯下調CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，差異有統計學意義，可見中藥方對于下調Lewis肺癌小鼠水平有較好的作用。中藥和化療對降低Lewis肺癌小鼠脾臟CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例具有協同作用，這表明益氣溫陽方可以有效抑制腫瘤相關指標，提高機體免疫功能。在臨床上，我們可以通過降低CD4+CD25+Treg細胞比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，避免機體的免疫抑制，延長患者生存期，這對于臨床具有重大意義。

綜上所述，益氣溫陽方在抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤生長、延長小鼠生存期、降低CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例與順鉑組差異無統計學意義，可能通過降低小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例來增強機體的抗腫瘤免疫應答，以達到治療腫瘤的目的。

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（2020-06-30收稿 責任編輯：王明）