慢性阻塞性肺疾病差異基因與中藥預測的生物信息學分析

吳思騏 劉建博

摘要 目的：通過生物信息學技術分析比較慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者與健康人的基因芯片數據，初步篩選COPD的差異表達基因，并借助差異表達基因預測治療COPD的潛在中藥藥物。方法：首先通過R分析GSE27597和GSE106986基因數據，得到139個差異表達基因，對差異表達基因進行基因本體（GO）富集分析，并通過String數據庫、Cytoscape軟件及其插件分析得到14個核心基因，然后對核心基因進行Reactome、KEGG、PANTHER等通路注釋，最后通過核心基因與醫學本體信息檢索平臺（Coremine Medical）相互映射，篩選治療COPD的中藥。結果：通過MCODE篩選出14個核心基因包括MMP8、PTX3、DEFA4、CHRM2、FPR2、CX3CR1、FPR1、ORM1、APLNR、PPBP、CHIT1、AGTR2、ARG1，與中性粒細胞脫顆粒、先天免疫系統、趨化因子信號通路等密切相關，其中FPR1和CX3CR1通過影響中性粒細胞向肺部的遷移活動成為COPD病理變化的關鍵。治療COPD的潛在中藥藥物包括黃連、黃芪、黃芩、半夏、丹參、厚樸、姜黃、郁金、瓜蔞等。結論：部分基因會促進香煙煙霧暴露誘發COPD的發生，通過miRNA進行調節可能是中藥治療COPD的潛在作用機制。

關鍵詞 差異表達基因;慢性阻塞性肺疾病;微小RNA;中藥;香煙煙霧

Abstract Objective：By analyzing and comparing the gene chip data of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） patients and healthy people through bioinformatics technology，the differentially expressed genes of COPD are initially screened，and the potential Chinese medicinal drugs for the treatment of COPD are predicted with the help of differentially expressed genes.Methods：The gene expression profiles of lung tissues of COPD cases and healthy cases were obtained from GSE27597 and GSE106986 of the Gene Expression Omnibus.A otal of 139 differentially expressed genes were obtained，and we performed gene ontology （GO） enrichment analysis of differentially expressed genes，and obtained 14 core genes through String database，Cytoscape software and its plug-in analysis，and then we performed Reactome，KEGG，PANTHER and other pathways on the core genes.Finally through the mutual mapping between core genes and the medical ontology information retrieval platform （Coremine Medical），we screened Chinese medicinal for the treatment of COPD.Results：A total of 14 core genes screened by MCODE including MMP8，PTX3，DEFA4，CHRM2，FPR2，CX3CR1，FPR1，ORM1，APLNR，PPBP，CHIT1，AGTR2，ARG1，and neutrophil degranulation，innate immune system，chemokines signal pathways were closely related，among which FPR1 and CX3CR1 have become the key to the pathological changes of COPD by affecting the migration of neutrophils to the lungs.Potential Chinese medicinals for the treatment of COPD include Rhizoma Coptidis，Radix Astragali seu Hedysari，Radix Scutellariae，Rhizoma Pinelliae，Radix Salviae Miltiorrhizae，Cortex Magnoliae Officinalis，Rhizoma Curcumae Longae，Radix Curcumae，Fructus Trichosanthis.Conclusion：Some genes can promote the occurrence of COPD induced by cigarette smoke exposure，and regulation by miRNA may be a potential mechanism of Chinese medicinal in the treatment of COPD.

Keywords Differentially expressed gene; Chronic obstructive pulmonary disease; miRNA; Chinese medicinal; Cigarette smoke

中圖分類號：R282;R563文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.023

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmoriary Disease，COPD）是以持續性呼吸道癥狀和氣流受限為主要特征的一種呼吸系統常見病，感染是誘發COPD急性加重的主要原因，香煙煙霧則是COPD最重要的獨立危險因素[1]。COPD是全球第4大死因，根據2020年COPD全球創議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease）可知，隨著發展中國家吸煙率的升高和高收入國家老齡化加劇，COPD的發病率在未來40年仍會繼續上升，至2060年可能每年有超過540萬人死于COPD及其相關疾病[2]。目前COPD的基礎治療用藥為吸入性支氣管擴張劑，而在COPD的防治過程中，戒煙的重要性越來越得到認可。

盡管吸煙是COPD的重要誘因，但并非所有吸煙者都必然發展為COPD患者。部分COPD患者無明顯的香煙煙霧暴露史，也發展為重癥COPD，可見吸煙與COPD之間存在著復雜的內在關系。有研究表明，COPD具有一定的遺傳性，但其具體機制尚不清楚。因此，本研究著眼于健康吸煙者與COPD患者、健康非吸煙者與COPD患者的差異表達基因，通過生物信息學分析，嘗試從基因水平探尋COPD的發病因素。同時通過差異表達基因預測防治COPD的中藥，并從活性單體、蛋白分子、miRNA等多個層面探討其作用機制，從發病原因到治療方法對COPD進行全面的剖析。

1 資料與方法

1.1 數據提取 從國家生物技術信息中心基因表達綜合數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了GSE27597和GSE106986 2個數據集。其中GSE27597包含了64例COPD患者的肺組織樣本和16個來自健康供體的樣本的mRNA表達譜[3]，GSE106986包含了14例COPD患者的肺組織樣本和5個來自健康供體的樣本的mRNA表達譜[4]。二者的表達譜來自Affymetrix Human Exon 1.0 ST GeneChip和Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2平臺。

1.2 差異基因的篩選 使用R軟件的注釋包對2個數據集的探針ID進行轉換并將二者集合并為一個數據集，利用R包（sva包和limma包）對2個數據集進行批量歸一化。通過R 3.60中的limma包篩選COPD病例與對照組之間的差異表達基因，以log2 fold change（簡稱log2FC）的絕對值>1.0和P<0.05作為篩選標準，篩選出差異表達基因（Differentially Expressed Gene，DEG）。其中，log2FC為負數的基因為下調基因，log2FC為正數的基因為上調基因。利用R語言制作差異表達基因火山圖。

1.3 差異基因的功能注釋 對差異基因進行多個層面的功能注釋，包括基因本體（GO）富集分析和生物過程富集分析?；虮倔w（GO）富集分析包含以下3個方面：細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過程（BP）。借助R語言的clusterProfiler包和ggplot2包進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析和可視化。同時，通過Funrich軟件（Funrich 2.1.2）尋找差異基因富集的生物通路。

1.4 核心基因的篩選和功能注釋 使用STRING數據庫（https：//string-db.org/）分析顯著差異表達基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并將得到的PPI網絡導入Cytoscape軟件（version 3.8.0），利用CytoHubba[5]插件和MCODE插件進行PPI分析（篩選標準：combined score>0.4）和網絡分析。MCODE可以發現PPI網絡中緊密聯系的區域，同時兼顧到網絡邊緣的分子，避免了因高通量技術帶來假陽性影響，更有利于挖掘與特定功能相關的分子集合。通過KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）進行通路富集，尋找核心基因富集的通路，并通過string構建核心基因之間的交互作用網絡。

1.5 靶點對接及中藥預測 將篩選出的核心基因與Coremine Medical（http：//www.coremine.com/）相互映射，篩選出核心基因相關的治療中藥，根據P<0.05篩選出差異有統計學意義的中藥。

2 結果

2.1 差異基因 基于GSE27597和GSE106986的原始數據，以log2FC的絕對值>1.0和P<0.05為篩選標準，共得出139個差異表達基因，其中包括62個上調基因和77個下調基因。見表1，圖1。

2.2 差異基因的功能注釋 GO發現上調的差異表達基因主要與中性粒細胞活化、中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞活化參與免疫反應、中性粒細胞介導的免疫應答等生物過程有關，它們介導的分子則富集于以下生物過程：碳水化合物結合、肽結合、細胞因子受體活性、G蛋白偶聯肽受體活性等。見圖2。在生物通路方面，差異基因富集于肽配體結合受體、整合素細胞表面相互作用、鈣調神經磷酸酶調節淋巴細胞中NFAT依賴性轉錄等通路。見圖3。且較之其他部位，這些差異基因在肺組織的表達程度更高。見圖4。為差異基因與COPD的相關性提供佐證。

2.3 核心基因的篩選及功能注釋 首先，以required confidence（combined score）>0.4為PPI關系的閾值，利用String數據庫進行PPI分析，并下載相關TSV格式文件，得到PPI關系對文件。接著，使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件對其進行下一步分析，發掘復雜網絡中的關鍵目標和子網絡;然后使用Cytoscape軟件的MCODE插件對其進行模塊分析。CytoHubba分析依據degree值找到14個表達量最高的基因（CX3CR1、PPBP、PTGS2、FPR1、FPR2、VCAM1、S100A12、ARG1、EGR1、CD163、FGG、ORM1、S100A8，S100A9），MCODE分析則得到3個重要模塊（MMP8、PTX3、DEFA4、CHRM2、FPR2、CX3CR1、FPR1、ORM1、APLNR、PPBP、CHIT1、AGTR2、ARG1;S100A9、VNN2、S100A12、AQP9、CEACAM4、S100A8;NR4A3、ATF3、EGR2、EGR3、EGR1、FOSB）。Hubba篩選出的模塊1包含了Cytohubba篩選出的14個基因中表達量最高的4個基因，且富集于特定的功能，同時囊括了上調表達基因與下調表達基因，更能全面反映差異表達基因對COPD的影響，因此選擇MOCDE篩選出的模塊1所包含的14個基因作為核心基因。見圖5～7。

通過KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）對篩選出的14個核心基因進行通路富集分析，其中涵蓋了Reactome、KEGG、PANTHER等多個數據庫。根據Reactome數據庫，14個核心基因主要富集于中性粒細胞脫顆粒、先天免疫系統、免疫系統，KEGG通路方面，14個核心基因則富集于神經活性配體-受體相互作用、金黃色葡萄球菌感染、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用等通路。趨化因子和細胞因子信號轉導途徑介導的炎癥是PANTHER預測的核心基因富集的生物過程。見表2。

將14個核心基因映射到CoremineMedical數據庫，以P<0.05為篩選標準，篩選治療COPD潛在中藥，共篩選出35種可能具有防治COPD的中藥。見表3。

3 討論

3.1 COPD與健康人之間存在差異基因 盡管吸煙是COPD發病最重要的危險因素，但吸煙與COPD并非簡單的線性關系。本研究綜合分析了COPD與健康吸煙者以及COPD與健康非吸煙者的DEG，表明COPD的易感性與基因有關。顯然，COPD并非單基因疾病，其發病與否受到多種基因的共同調節，且部分差異基因之間存在明顯的相互作用。

3.2 核心基因與COPD存在著復雜關系 本研究篩選出14個核心基因，并提示CX3CR1、APLNR、CHIT1、AGTR2的高表達與COPD正相關，MMP8、PTX3、DEFA4、FPR2、FPR1、ORM1、PPBP、ARG1的低表達與COPD負相關。它們通過多種通路和生物過程，對COPD的誘發、病情進展、疾病預后起到重要的影響。而根據Cytohubba結果，CX3CR1、FPR1、FPR2、ORM1、PPBP、ARG1表達量最高，與COPD的發病關系也最為密切。

CX3CR1具有促進結構破壞和重塑的作用，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺氣腫等慢性炎癥性肺部疾病的發生發展中發揮重要作用。釋放CX3CR1的趨化性炎癥細胞可能導致單個核細胞在肺實質和肺血管壁聚集，釋放介質誘導損傷，刺激增殖和趨化性炎癥細胞[6]。單核巨噬細胞通過產生TNF-α和IL-6對香煙煙霧產生先天免疫應答，從而促進肺氣腫的發生[7]，而CX3CR1作為單核巨噬細胞的產物，在這個過程中不可或缺。

FPR1的激活可觸發中心粒細胞的多種功能，包括趨化性、脫顆粒、產生ROS和吞噬作用，并參與了香煙煙霧誘導的COPD炎癥的發生。Leslie等[8]表明FPR1基因的缺乏降低了肺部發生炎癥和纖維化的風險，同時也證明了FPR1基因表達上調對中性粒細胞產生重要影響，使之能夠在肺纖維化中發揮特異性的關鍵作用，對于患病肺的病理組織重塑至關重要。另有研究表明，COPD患者肺中的中性粒細胞顯著增多，并且中性粒細胞相關的產物與COPD的發生和嚴重程度相關[9]。FPR1與香煙煙霧暴露下中性粒細胞的肺部轉移程度負相關也在動物實驗中得到驗證[10]。纖維化和肺部炎癥是COPD的重要表現，香煙煙霧會導致中性粒細胞向肺內遷移從而發生炎癥反應，而FPR1基因下調減少了中性粒細胞向肺的遷移，這為闡明香煙煙霧與COPD的個體差異性提供了一種可能解釋。

ORM1編碼的血漿蛋白在急性炎癥顯著增加，被歸類為急性期反應物。有研究通表明AECOPD患者的ORM1的基因和蛋白質表達顯著高于穩定COPD或健康對照者[11]。

PPBP能刺激滑膜細胞的纖溶酶原激活物的形成和分泌，是一種強有力的中性粒細胞趨化劑和激活劑，其在支氣管黏膜的高表達可能參與了COPD的發病[11]。ARG1、FPR2與COPD的發病也有一定關系。

FPR1和CX3CR1與COPD的發病機制與病情進展密切相關，并得到深入研究，它們影響了香煙煙霧暴露情況下中性粒細胞的活動，其表達量的差異使得個體在COPD的發病和進展中呈現出不一樣的轉歸，為揭示COPD易感性與差異性提供了遺傳水平的解釋。

3.3 相關中藥防治COPD的潛在機制探討

通過Coremine Medical篩選出的中藥包括了臨床中治療COPD的常用藥物。實驗表明，相關中藥及其活性分子與對COPD的治療有積極的作用，同時它們的作用機制也與對應的核心基因密切相關。此外，部分中藥可能通過影響COPD相關的miRNA而對疾病的進展產生影響，并得到了實驗證明。

3.3.1 中藥的活性成分治療COPD的分子機制 ? 有研究表明，半夏生物堿可能通過抑制TNF-α和NO等早期炎癥介質的釋放而保護損傷的肺上皮細胞，同時抑制IL-8和ICAM-1的表達、緩解IL-8和ICAM-1過表達而觸發的中性粒細胞趨化作用，減緩中性粒細胞聚集，延緩肺損傷的發展[12]。而中性粒細胞聚集正是差異基因GO富集分析的主要通路之一。厚樸酚能通過抗氧化及抗炎作用抑制膿毒癥大鼠急性肺損傷[13]，同時可通過減輕肺纖維化大鼠的肺組織纖維化程度，降低肺組織含量，達到抗肺纖維化作用[14]。另有研究表明，厚樸揮發油可能通過降低炎癥組織PGE2、TNF-α和IL-1β水平從而發揮抗炎作用[15]。有研究表明，黃芪多糖可通過抑制COPD大鼠肺組織MMP9、TIMP1的表達、改善肺組織損傷及肺功能[16]。

根據中藥的功能分類，預測的治療COPD潛在靶點的藥物大致可分為以下5類：止咳化痰平喘藥（半夏、瓜蔞）、清熱藥（黃芩、大黃、黃連）、補虛藥（黃芪、干姜、吳茱萸）、活血化瘀藥（丹參、姜黃、郁金）、理氣藥（厚樸）。其中黃芪補益肺脾之氣，臨床研究表明，COPD患者大多有肺脾氣虛，黃芪也是臨床上最常應用于COPD治療的中藥之一[17]。肺脾腎虛是COPD患者最主要的病機，急性加重期患者往往受到痰熱、痰濕、瘀血等病理因素的影響，預測的中藥也涵蓋了多種中醫病理因素，體現了中醫“標本兼治”的思想。瓜蔞清熱滌痰，半夏燥濕化痰，而痰濕是COPD主要的病理因素及病理產物，二者聯用可有效減輕COPD的癥狀，對COPD起到治療作用。肺主一身之氣，主宣發肅降，肺氣受損，氣機升降失司，則發為喘，厚樸燥濕消痰、下氣除滿，在COPD的治療中得到廣泛應用，療效顯著。黃芩、大黃、黃連、干姜、吳茱萸、丹參、姜黃、郁金對COPD的療效也得到臨床研究的證實[18-21]。

3.3.2 miRNA可能是中藥干預COPD進程的關鍵 ?微小RNA（microRNA，miRNA）是在多種真核細胞及病毒中發現的一類參與基因表達調控的非編碼單鏈RNA。近期研究表明，植物來源的miRNA可以穩定地存在于動物的血液與組織器官中、并參與調控多種靶點蛋白的表達而發揮作用。尹作靜等[22]發現黃連素和吳茱萸堿作用于肝癌細胞后hsa-miR-188-5p的表達量升高，而hsa-miR-188-5p與CX3CR1相關聯，由此推測，黃連素可能通過上調hsa-miR-188-5p的表達干預CX3CR1的表達，從而影響COPD的進程。研究表明，丹參酮ⅡA的抗炎功效與多種miRNAs密切相關，通過下調miR-155、miR-147、miR-184、miR-29b和miR-34c表達，從而降低細胞因子、趨化因子和急性期GM-CSF、sICAM-1、cxcl-1、MIP-1α水平，抑制核因子κB活化，降低TNF-α、IL-1β、COX-2的水平，這些因子與COPD的發病及進展有著密切的關系[23]。彭先祝[24]發現參芪補肺方通過介導miRNA-146a對煙霧溶液誘導COPD效應細胞，正向調控Nrf2表達，負向調控核因子κB表達。黃芪總黃酮可通過抑制miRNA-21，增加Smad7表達，使TGF-β1/Smad激活能力下降，抑制肺纖維化中上皮細胞間質轉分化的作用[25]。有研究表明，吸煙者和COPD患者的血清中miRNA-21的水平較高，并且與第1秒用力呼氣容積比用力肺活量（FEV1/FVC）的呼氣量負相關[26]。而miRNA-21能夠促進肺成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，可能是COPD氣道重塑的重要機制[27]。

研究表明，部分miRNA與COPD密切相關，可作為診斷和預后的生物標志物，miRNA作為COPD治療靶點更具有廣泛的應用前景[28]。部分中藥可能通過調控miRNA影響COPD的病理變化，進而對COPD的發生和發展產生影響。從miRNA的層面對中藥進行分析，為COPD的研究提供了新的思路，為理解COPD發生過程中的復雜分子機制提供了新的視角，也為進一步推動臨床藥物研發提供了依據。然而，考慮到本研究尚有一定的局限性，未來還需要進一步開展更為深入的實驗驗證。

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（2020-10-26收稿 責任編輯：張雄杰）