MicroRNA-409-3p通過靶向ZEB1促進HCMV感染的膠質瘤細胞遷移的機制研究

余波 張丙旭 鐘文靜 王斌 錢冬萌 胡明

摘要：近年來的臨床研究顯示人巨細胞病毒（HCMV）與神經膠質瘤關系密切，但HCMV促進膠質瘤進展的機制仍未闡明，而microRNA（miRNA）在神經膠質瘤中被檢測到異常表達，因此提出潛伏感染的HCMV會通過調節宿主細胞miRNA從而影響神經膠質瘤發生發展的假設。首先通過轉錄組分析和細胞實驗，證實miR-409-3p在HCMV感染后顯著下調。生物信息學預測顯示鋅指結合蛋白1（ZEB1）為其下游靶基因。miR-409-3p過表達后的細胞劃痕實驗以及Transwell遷移實驗證實，miR-409-3p的過表達會導致ZEB1下調并抑制膠質瘤U87細胞遷移，而外源性過表達ZEB1可恢復U87細胞遷移能力。研究結果表明，潛伏感染的HCMV能夠通過下調宿主細胞中miR-409-3p，從而上調ZEB1表達，促進神經膠質瘤細胞遷移。

關鍵詞：人巨細胞病毒;microRNA-409-3p;ZEB1;膠質瘤

中圖分類號：R373.9

文獻標志碼：A

文章編號：1006-1037（2021）03-0056-07

人巨細胞病毒（HCMV），也稱為人皰疹病毒5（HHV-5），屬于皰疹病毒科的β亞科，是一種大多數人體內均存在的雙鏈DNA病毒[1]。據報道，40%和95%的人被HCMV感染，但由于HCMV的復制受到自身免疫系統的限制，所以在人體中常為潛伏狀態[2]。但作為重要的臨床病原體，HCMV可以在免疫抑制或免疫功能低下的患者體中重新激活，導致患者疾病進一步發展，甚至死亡[3]。神經膠質瘤是世界上最常見的惡性腦腫瘤，其顯著特點是彌漫性浸潤，轉移率高，生存結果極差[4]，且臨床治療效果不佳，預后差，復發率高。2002年，Cobbs首次報道HCMV可能與神經膠質瘤有關[5]，隨后研究人員發現更昔洛韋（一種病毒DNA合成抑制劑）對神經膠質瘤患者有明顯的治療作用[6]，以及HCMV感染可通過調節關鍵致癌信號通路的活性來促進神經膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲[7-8]，并通過干擾p53和視網膜母細胞瘤（Rb，一種抑癌基因）抑制HCMV感染的細胞的凋亡[9]。然而，HCMV感染與神經膠質瘤的具體發生機制仍不明確。越來越多的研究表明，微小RNA（miRNA）作為一種單鏈非編碼RNA，一類新的內分泌因子[10-11]，在所有真核細胞或病毒中表達，并在轉錄后通過與下游靶mRNA互補結合，負調控基因表達[12-13]。研究表明神經膠質瘤中miRNA表達失調[14]，miRNA與HCMV之間也有著密切的關聯[15]。在HCMV感染后的膠質瘤細胞中miRNA的表達顯著改變[16]，但關于HCMV感染期間的神經膠質瘤細胞中miRNA的表達和功能的認識還相對缺乏。ZEB1是一個以鋅指簇結構為特征，負責與CAGGTA盒狀啟動子元件相互作用的轉錄因子[17-18]，ZEB1在調節癌細胞功能（例如細胞存活、分化、增殖、衰老和凋亡）中起著至關重要的作用[19]。ZEB1在人類癌癥組織中異常表達與細胞遷移、侵襲、腫瘤轉移密切相關[20]。本研究擬討論miR-409-3p/ ZEB1信號通路在HCMV感染的神經膠質瘤細胞U87中的作用，為神經膠質瘤的基礎診斷和治療提供新的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 神經膠質瘤細胞系U251，U87，T98由本實驗室保存。于37℃，5%CO2無菌條件下培養細胞，待細胞狀態穩定后開始實驗。HCMV為ADl69株，使用人胚肺成纖維細胞（HELF）擴增病毒，并使用軟瓊脂法定量病毒滴度。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清（FBS，Biological Industries），DMEM/F12（Biological Industries），MEM（Biological Industries），二甲基亞砜（DMSO，索萊寶），細胞RNA提取試劑盒（天根），cDNA合成試劑盒（諾唯贊），Transwell小室（康寧），IE86抗體（abcam），ZEB1抗體（博奧森），ACTIN抗體（博奧森），pp65抗體（博奧森） ，Real-time PCR儀（Bio-Rad iQ5）。

1.2 實驗方法

（1）細胞培養。在37°C，5%CO2的培養箱中，使用含10%胎牛血清的MEM（培養液進行人神經膠質瘤細胞系（T98，U251和U87）培養。

（2）RNA提取，文庫構建和測序。使用TRIzol提取每個樣品的總RNA。通過PAGE凝膠純化特定大小的microRNA分子。RNA-seq文庫通過6個步驟構建：連接5'RNA接頭;連接3’RNA適配器;通過反轉錄反應獲得cDNA測序文庫;通過高保真聚合酶擴增構建測序文庫; DNA擴增;在Illumina HiSeq2500上測序。

（3）螢光素報告測定。分別構建包含ZEB1 3'-UTR區域或3'-UTR突變區域的熒光素酶報告基因質粒（pMIR-3'-UTRWt和pMIR-3'-UTRMut）。將pMIR-3'-UTRWt或pMIR-3'-UTRMut質粒與miRNA模擬物共轉染到U87細胞中。48小時后，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測miR-409-3p和ZEB1之間的結合效率。

（4）細胞劃痕實驗。將膠質瘤細胞接種在6孔板中，并培養至70%匯合，轉染質粒，48小時后，用200μL吸頭刮擦細胞層，然后用PBS沖洗，無血清MEM培養基培養24小時，在倒置顯微鏡下拍攝。

（5）Transwell試驗。將含有20%FBS的MEM添加到24孔板的底部，用無血清MEM將細胞重懸，接種于24孔板中的Transwell小室中，密度為5×105個細胞/mL，培養6小時后，將Transwell小室膜用甲醇固定15分鐘，然后用結晶紫染色，在顯微鏡下隨機選擇五個視野（100倍），拍照計數。

（6）總RNA提取和定量RT-PCR（qRT-PCR）。用總RNA提取試劑盒從細胞系中提取總RNA。使用SYBR qPCR Master Mix進行實時PCR，以GAPDH表達標準化。ZEB1（forward：5'- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3'，reverse：5'-TGCACCTTCTGTCTCGGTTTCTT -3'）和GAPDH（forward：5'-GAGTCAACGGATTTGGTC G-3'， reverse：5'-TGGAAGATGGTGATGGGA-3'）。使用2-ΔΔCt方法計算表達倍數變化。

（7）Western blot。將細胞總蛋白液與上樣緩沖液混合，95°C加熱5分鐘。在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離樣品后，將蛋白質轉移到PVDF膜上，5%的奶粉封閉2小時，一抗4℃過夜：兔抗ZEB1（1∶1 000），兔抗IE86（1∶1 000），兔抗pp65（1∶1 000）和兔抗ACTIN（1∶1 000）。用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的抗兔二抗1∶5 000的稀釋，室溫結合一抗2小時，最后使用ECL化學發光試劑進行顯影，ImageJ軟件分析蛋白質條帶。

2 實驗結果與討論

2.1 RNA-Seq揭示miR-409-3p在HCMV感染的神經膠質瘤細胞中的表達

為了研究HCMV感染后的神經膠質瘤中miRNA的表達情況，采用RNA-Seq技術對HCMV感染后的U87細胞中miRNA進行測序。使用small RNA Sample Pre Kit試劑盒構建文庫，由于Small RNA的5'端有磷酸基團，3'端有羥基，利用T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2（truncated）分別在small RNA 5'端和3'端連接上接頭，反轉錄合成cDNA，再以cDNA作為模板，進行PCR擴增，采用Illumina HiSeq2500（單端50 nt）將構建好的測序文庫進行測序。每個樣品的clean data均大于11 M，Q30百分率超過97.79%。將過濾后的clean data與Silva，GtRNAdb和Rfam比對，去除核糖體RNA和轉運RNA。然后使用miRDeep2程序將未注釋的與由人（GRCh38_100，Ensembl）和HCMV菌株AD169完整基因組（gb：FJ527563）組成的索引進行比對，確定每種miRNA的表達量，并使用每百萬轉錄本（TPM）標準化表達量。DEGseq用于分析組之間的差異。

以| log2（FC）|≥1和FDR≤0.01作為差異表達miRNA的篩選標準，倍數變化（FC）代表兩個樣品組之間表達水平的比率。共鑒定出1 395個miRNA，為了研究HCMV感染對U87細胞中miRNA表達的潛在影響，在感染和模擬感染的細胞中鑒定出了差異表達的miRNA。根據兩組的miRNA表達的火山位點圖可知（圖1），與模擬感染組相比，感染后，有30個miRNA被下調，4個miRNA被上調。在全面分析LogFC，FDR和miRNA功能預測后，選擇了miR-409-3p（log2FC = -4.38，FDR = 0）。此外，通過靶基因預測（TargetScan：http：//www.targetscan.org/）分析，ZEB1與miR-409-3p種子序列能夠結合，且最小自由能小，結合穩定性高，ZEB1很可能是 miR-409-3p的靶基因（圖2）。

2.2 在膠質瘤U87中驗證HCMV感染后miR-409-3p的表達，及靶向調節ZEB1

通過qRT-PCR檢測miR-409-3p、ZEB1分別在HCMV感染與未感染的U251，U87和T98細胞中的表達水平。miR-409-3p在HCMV感染的U251，U87和T98細胞中顯示低水平（圖3（a），P <0.05），而ZEB1 mRNA（圖3（b），P <0.05）和蛋白質（圖4（a）、圖4（b），P <0.05）表達顯著增加，這些觀察結果表明miR-409-3p的下調與HCMV感染的神經膠質瘤細胞中的ZEB1表達可能相關。接下來，在U87細胞中，將野生型/突變型ZEB1熒光素酶報告載體（pEF1α-3'-UTRWt和pEF1α-3'-UTRMut）與miR-409-3p mimic/miR-NC共轉染并培養48小時，然后進行熒光素酶報告基因檢測，顯示pEF1α-3'-UTRWt與miR-409-3p mimic共轉染組螢光素酶活性最低（圖5），螢光素酶活性在3'-UTRMut組中沒有受到影響。這些結果證實，miR-409-3p直接靶向U87細胞中ZEB1的3'-UTR。

2.3 MiR-409-3p的過表達和ZEB1的回復顯著改變了HCMV感染的U87細胞的遷移能力

IE86是HCMV感染后表達的重要即刻早期調控蛋白。通過IE86最高表達量選擇最佳感染時間點，實驗結果顯示72小時為最佳感染時間點（圖6）。在HCMV感染的U87細胞中過表達miR-409-3p，劃痕試驗顯示，miR-409-3p過表達組細胞遷移能力降低（圖7、圖8（a）），相似的，Transwell遷移實驗結果顯示，miR-409-3p過表達組細胞的遷移能力降低（圖7、圖8（b））。此外，qRT-PCR（圖9）和Western blot（圖10）顯示，miR-409-3p過表達組ZEB1的mRNA和蛋白水平顯著降低;隨后，將沒有3'-UTR的全長ZEB1克隆與miR-409-3p共轉染到HCMV感染的U87細胞中，對ZEB1進行qRT-PCR和Western blot分析，發現ZEB1表達得以恢復（圖9、圖10）。同時，Transwell和劃痕試驗的結果表明ZEB1回復組的遷移能力也被明顯恢復（圖7、圖8）。這些結果表明恢復ZEB1表達可以逆轉由miR-409-3p過表達引起的遷移能力抑制現象。

2.4 討論

隨著研究的深入，miRNA在致癌和腫瘤惡性進展中的作用受到越來越多的關注[21-22]，miRNA在多種因素影響下均可異常表達，病毒是其中重要的影響因素之一，而HCMV病毒對神經干細胞、神經元及神經膠質細胞普遍易感。根據研究報道，miR-409-3p在不同類型的癌癥中發揮重要作用，例如通過調節Beclin-1來增強結腸癌細胞的化學敏感性[23]，靶向并抑制胃癌中的PHF10作為腫瘤抑制因子[24]，靶向c-Met抑制膀胱癌細胞的遷移[25]，靶向連環蛋白δ1抑制骨肉瘤轉移[26]等。實驗發現miR-409-3p在HCMV感染的神經膠質瘤中也異常表達，并且可以通過作用于ZEB1進而調控膠質瘤細胞的遷移能力。

3 結論

在HCMV感染膠質瘤U87細胞的體外實驗中，轉錄組測序結果提示miR-409-3p的表達下降，并發現ZEB1為miR-409-3p靶基因，過表達miR-409-3p和導敲低ZEB1均可以使細胞遷移能力降低，而在miR-409-3p過表達中回復ZEB1表達的細胞中，細胞遷移能力得到一定程度恢復，綜上表明，HCMV感染的U87細胞可以通過降低miR-409-3p表達導致ZEB1表達增強從而使細胞遷移能力增強。有研究表明ZEB1可以抑制E-cadherin的表達[27]，并進一步誘導EMT，EMT被認為是促進癌細胞遷移并導致轉移的重要機制，而該機制是否也存在于HCMV感染的神經膠質瘤細胞中，還需要進行進一步研究。

參考文獻

[1]ALARCON A， MARTINEZ-BIARGE M， CABAAS F，et al. A prognostic neonatal neuroimaging scale for symptomatic congenital cytomegalovirus infection[J]. Neonatology ，2016， 110（4）： 277-285.

[2]HAHN F， NIESAR A， WANGEN C et al. Target verification of artesunate-related antiviral drugs： assessing the role of mitochondrial and regulatory proteins by click chemistry and fluorescence labeling[J/OL]. Antiviral Research， 2020： 104861[2020-12-15]. https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32590041. DOI：10.1016/j.antiviral. 2020.104861.

[3]COLLINS-MCMILLEN D， CHESNOKOVA L， LEE B J，et al. HCMV infection and apoptosis： How do monocytes survive hcmv infection？[J]. Viruses，2018， 10（10）， 533.

[4]OSTROM Q T， GITTLEMAN H， XU J，et al. CBTRUS statistical report： Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the united states in 2009-2013[J]. Neuro-Oncology，2016， 18： v1-v75.

[5]COBBS C S， HARKINS L， SAMANTA M，et al. Human Cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma[J]. Cancer Research，2002， 62（12）： 3347-3350.

[6]DROPULIC L K， COHEN J I. Update on new antivirals under development for the treatment of double-stranded dna virus infections[J/OL]. Clinical Pharmacology and Therapeutics， 2010， 88（5）： 610-619[2021-01-15]. https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20881959. DOI：10.1038/clpt.2010.178.

[7]COBBS C S， SOROCEANU L， DENHAM S，et al. Modulation of oncogenic phenotype in human glioma cells by cytomegalovirus IE1-mediated mitogenicity[J]. Cancer Research，2008， 68（3）： 724-730.

[8]王心惠，錢冬萌，王斌，等. HCMV感染對下調ATF5的人膠質瘤U251細胞干性的影響.[J].青島大學學報（自然科學版）2017，30（2）：40-44.

[9]CASTILLO J P， YUROCHK A D， KOWALIK T F. Role of human cytomegalovirus immediate-early proteins in cell growth control[J]. Journal of Virology，2000， 74（17）： 8028-8037.

[10] PENG C，WANG Y L. Editorial： MicroRNAs as new players in endocrinology[J]. Frontiers in Endocrinology，2018， 9：459.

[11] ZHANG J， LI S， LI L， et al. Exosome and exosomal microrna： Trafficking， sorting， and function[J]. Genomics Proteomics Bioinformatics， 2015， 13（1）：17-24.

[12] TREIBER T， TREIBER N. MEISTER G. Publisher correction： Regulation of microrna biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2019， 20（5）： 321.

[13] JI C， GUO X. The clinical potential of circulating micrornas in obesity[J/OL]. Nature Reviews Endocrinology， 2019， 15（12）： 731-743[2021-01-20]. http：//dx.doi.org/10.1038/s41574-019-0260-0. DOI：10.1038/s41574-019- 0260-0.

[14] SUN J， ZHENG G， GU Z，et al. MiR-137 inhibits proliferation and angiogenesis of human glioblastoma cells by targeting ezh2[J]. Journal of Neuro-Oncology，2015， 122（3）： 481-489.

[15] NAQVI A R， SHANGO J， SEAL A，et al. Viral mirnas alter host cell mirna profiles and modulate innate immune responses[J]. Frontiers in Immunology，2018， 9： 433.

[16] LIANG Q， WANG K， WANG B，et al. HCMV-Encoded mir-ul112-3p promotes glioblastoma progression via tumour suppressor candidate 3[J]. Scientific Reports， 2017， 7： 44705.

[17] FUNAHASHI J， KAMACHI Y， GOTO K，et al. Identification of nuclear factor delta ef1 and its binding site essential for lens-specific activity of the delta 1-crystallin enhancer[J]. Nucleic Acids Research，1991， 19（13）： 3543-3547.

[18] TAKAGI T， MORIBE H， KONDOH H，et al. DeltaEF1， a zinc finger and homeodomain transcription factor， is required for skeleton patterning in multiple lineages[J]. Development，1998， 125（1）： 21-31.

[19] CHRISTINE C L， MARJANOVIC N D， LEE T，et al. Poised chromatin at the zeb1 promoter enables breast cancer cell plasticity and enhances tumorigenicity[J]. Cell，2013， 154（1）： 61-74.

[20] KREBS A M， MITSCHKE J， LOSADA M L，et al. The EMT-Activator zeb1 is a key factor for cell plasticity and promotes metastasis in pancreatic cancer[J]. Nature Cell Biology，2017， 19（5）： 518-529.

[21] WANG Z， DAI X， CHEN Y，et al. MiR-30a-5p is induced by wnt/β-catenin pathway and promotes glioma cell invasion by repressing ncam[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 465（3）： 374-380.

[22] YUE X， CAO D， LAN F，et al. MiR-301a is activated by the wnt/β-catenin pathway and promotes glioma cell invasion by suppressing sept7[J]. Neuro-Oncology， 2016， 18（9）： 1288-1296.

[23] TAN S， SHI H， BA M，et al. MiR-409-3p sensitizes colon cancer cells to oxaliplatin by inhibiting beclin-1-mediated autophagy[J]. International Journal of Molecular Medicine，2016， 37（4）： 1030-1038.

[24] LI C， NIE H， WANG M，et al. MicroRNA-409-3p regulates cell proliferation and apoptosis by targeting phf10 in gastric cancer[J]. Cancer Letters，2012， 320（2）： 189-197.

[25] XU X， CHEN H， LIN Y，et al. MicroRNA-409-3p inhibits migration and invasion of bladder cancer cells via targeting c-met[J]. Molecules and Cells，2013， 36（1）： 62-68.

[26] WU S， DU X， WU M，et al. MicroRNA-409-3p inhibits osteosarcoma cell migration and invasion by targeting catenin-δ1[J]. Gene，2016， 584（1）： 83-89.

[27] THIERY J P. Epithelial-mesenchymal transitions in cancer onset and progression[J]. Bulletin de l'Académie Nationale de Médecine，2009， 193（9）： 1969-1978.