β連環素、核因子κB表達水平與尖銳濕疣患者角質形成細胞增殖能力的關聯性分析

楊秀玲

（河南省延津縣人民醫院病理科，河南 新鄉 453200）

尖銳濕疣（Condyloma acuminatum,CA）作為常見性傳播疾病，多發于青年群體，其患病率約為0.5%～1%，具有復發率高等特點[1]。相關研究表明，β連環素（β-catenin）作為環連蛋白家族成員，亦為Wnt信號轉導核心蛋白，參與病理進展及分化，改變細胞周期變化[2]。核因子κB（NF-κB）作為基因多向性核轉錄因子，通過參與多種基因轉錄調控，誘導其在惡性腫瘤中呈異常表達，進而參與CA病理進展。近年相關研究證實β-catenin、NF-κB在多種腫瘤中均存在表達異常現象，但其表達水平與CA關聯性研究較少[3-4]。基于此，本研究探討β-catenin、NF-κB在CA患者角質形成細胞增殖能力中的關聯性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院收治的CA患者92例（2019年1月至2021年1月）作為研究對象。納入標準：符合《尖銳濕疣治療專家共識（2017）》[5]診斷標準；肉眼可見菜花樣、雞冠樣贅生物；疣狀增生物多出現于肛門、肛周、會陰、生殖器等部位；無局部皮膚病；醋酸白試驗陽性。排除標準：合并其他帶狀皰疹感染類疾病；代謝性疾病；其他類型性病；精神疾病。

按照感染類型分為高危組（n=41）與低危組（n=51）。高危組男26例，女15例；年齡（25～62）歲，平均年齡（43.68±9.11）歲；病程（2～12）年，平均病程（7.06±2.43）年。低危組男31例，女20例；年齡（24～64）歲，平均年齡（44.10±9.92）歲；病程（1～10）個月，平均病程（5.54±2.20）個月。同時選取同期于我院檢查的112例健康體檢者作為健康體檢組，其中男65例，女47例，年齡（23～63）歲，平均年齡（43.24±9.88）歲，三組基線資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法 ① 檢測方法：取CA患者皮損組織、健康體檢組正常包皮、宮頸組織，使用石蠟包埋，制備切片，經脫蠟、水化處理后使用pH值7.4磷酸鹽緩沖液沖洗，修復抗原，使用過氧化物酶阻斷溶液，將標本方式于室溫下孵育，10min后加入第一抗體，室溫孵育過夜，后加之第二抗體，放置于室溫下孵育，10min后加入50g鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，繼續放置于室溫下孵育，10min后加入DAB顯色、復染、脫水、透明、封片，使用400倍顯微鏡，觀察標本染色情況，選取5個視野，計算100個細胞。② 角質形成細胞分離與培養：取CA患者皮損組織、健康體檢組正常包皮、宮頸組織，使用PBS溶液浸泡10min，后使用PBS溶液洗滌3次，后將上述組織剪為小塊，再次使用PBS溶液洗滌2次，加入Dispase酶，于4℃冰箱中放置8h，吸出酶液使用PBS溶液洗滌2次，加入混合消化液，37℃環境中放置5min，使用胰酶抑制劑終止反應，吹打為單細胞懸液，離心5min，棄上清液，重懸細胞，接種至培養板中，細胞長至70%～80%傳代，細胞放置于-196℃液氮中保存，經免疫組化染色，倒置于顯微鏡下，溶細胞呈現為鋪路石狀，則鑒定為角質形成細胞。③ 標本陽性判定標準：染色強度評分：0分（無染色）、1分（淡黃色）、2分（黃色）、3分（棕褐色）。陽性細胞百分比評分：0分（陽性細胞百分比＜5%）、1分（陽性細胞百分比為5%～25%）、2分（陽性細胞百分比為26%～50%）、3分（陽性細胞百分比為51%～75%）、4分（陽性細胞百分比＞75%）。根據上述兩項評分，將得分相加，≤2分為陰性，＞2分為陽性。④ 角質形成細胞增殖能力：使用四唑鹽（MTT）比色法，將原代角質形成細胞制為懸液，接種至96孔板中，200μg/孔，3孔/組，孵育48h，后于孔內加入MTT溶液，繼續放置于培養箱中培養4h，最后放入二甲基亞砜終止反應，搖晃均勻后，檢測波長570mm處吸光度值。

1.3 觀察指標 ① 三組β-catenin、NF-κB表達情況。② 角質形成細胞增殖能力。③ β-catenin、NF-κB與角質形成細胞增殖能力的關聯性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0對數據進行分析，計量資料以（±s）表示，t檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗，采用Spearman進行相關性分析，計數資料以（n，%）表示，X2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-catenin、NF-κB表達情況 高危組、低危組β-catenin、NF-κB陽性率均高于健康體檢組（P＜0.05），見表1。

表1 β-catenin、NF-κB表達情況（n，%）

2.2 角質形成細胞增殖能力 伴隨時間延長，高危組、低危組角質形成細胞增殖能力呈升高趨勢（P＜0.05），見表2。

表2 角質形成細胞增殖能力（±s）

表2 角質形成細胞增殖能力（±s）

組別 例數 光密度值24h 48 h 72h 96h高危組 41 0.40±0.03 0.42±0.05 0.43±0.03 0.48±0.10低危組 51 0.40±0.05 0.41±0.04 0.42±0.04 0.44±0.06健康體檢組 112 0.38±0.04 0.38±0.03 0.41±0.03 0.42±0.05 F 5.997 22.348 5.972 12.732 P 0.003 ＜0.001 0.003 ＜0.001

2.3 β-catenin、NF-κB與角質形成細胞增殖能力的關聯性 經Spearman相關性分析，β-catenin、NF-κB與角質形成細胞增殖能力呈正相關（r1=0.472，P＜0.001；r2=0.627，P＜0.001）。

3 討論

CA多因HPV感染，誘發肛周及生殖器部分出現增生性病變，其發病率高居我國性傳播疾病第3位，僅次于非淋菌性尿道炎、淋病。目前臨床治療CA方法較多，但因復發率高居不下，嚴重影響患者生活及心理健康。鑒于目前臨床對β連環素、核因子κB表達水平與尖銳濕疣患者角質形成細胞增殖能力的關聯性分析研究較少，本研究通過研究β-catenin、NF-κB表達水平及CA患者角質形成細胞增殖能力，觀察其表達情況、增殖趨勢變化，以期為CA臨床診治及預防提供科學參考依據。

HPV最初感染時為角質形成細胞，伴隨機體內病毒DNA呈低水平時，逐步建立，形成穩定病毒基因組織，而后即可進入病毒周期生產階段，進而影響其他免疫細胞、炎癥反應、網絡通路等[6]。臨床認為，表皮細胞過度增殖，可促使真皮毛細血管增多，擴張管腔，誘發癌變。其中β-catenin作為新原癌基因產物，可通過結合多種蛋白質，促進腫瘤細胞增殖與分化，在不同類型細胞復合體內發揮不同生物學功能，并可通過平衡酪氨酸激酶與磷酸酯酶活性，達到抑制腫瘤細胞遷移及黏附[7-8]。另外，β-catenin作為Wnt信號通路中關鍵組成部分，可通過影響細胞遷移與黏附，調整靶基因轉錄，王云帆學者[9]認為，β-catenin蛋白表達水平與癌癥患者病理分級存在直接關聯。相關研究表明，CA患者于發病時，β-catenin水平mRNA表達水平呈異常狀態，其細胞周期亦會發生變化[10]。NF-κB作為多功能轉錄因子，可調節多種基因表達，抑制細胞凋亡，提高細胞周期蛋白D1表達水平，促進細胞增殖及進展。除此之外，NF-κB可通過參與細胞增殖、促進血管生成、抑制細胞凋亡等方式參與CA病情進展[11]。本研究結果顯示，高危組、低危組β-catenin、NF-κB陽性率高于健康體檢組，且伴隨時間延長，高危組、低危組角質形成細胞增殖能力呈升高趨勢，β-catenin、NF-κB與角質形成細胞增殖能力呈正相關（P＜0.05）。可見，β-catenin、NF-κB可作為臨床評估CA疾病感染類型的參考依據。

綜上，β-catenin、NF-κB表達水平與CA患者角質形成細胞增殖能力呈正相關，時間越長，光密度值越高，細胞繁殖能力越強，因此，其表達水平可作為臨床評估患者疾病感染類型的有效指標。