分化型甲狀腺癌神經內分泌分化與131I治療療效的關系

吳凡 李林法 程國平 戴五敏 易賀慶

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤[1]，其中分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）占90%以上[2]，包括乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）及濾泡狀甲狀腺癌（follicle thyroid cancer，FTC）。131I治療可以降低DTC患者術后復發風險、延長患者生存時間，是DTC術后治療的重要手段之一。甲狀腺癌組織能較好攝碘是131I治療有效的前提，但有部分患者病灶失去攝碘能力而對131I治療抵抗，導致治療效果不理想[3]。神經內分泌分化（neuroendocrine differentiation，NED）存在于各種惡性腫瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌等，在各種腺癌中的檢出率為16%～75%。發生NED的腫瘤細胞可在轉錄因子的調控下通過自分泌、旁分泌等途徑刺激周圍腫瘤細胞生長及增殖，降低凋亡能力，導致預后不良，但關于其在DTC的131I治療過程是否發揮作用的相關報道較少。因此，筆者通過免疫組化法分析NED標志性蛋白嗜鉻粒蛋白A（chromograninA，CgA）、神經細胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，CD56）、突觸蛋白（synaptophysin，Syn）和碘代謝關鍵基因促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）、鈉碘同向轉運體（sodium iodide symporter，NIS）在DTC組織中的表達情況，探討DTC的NED與131I治療療效的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）生物樣本庫中46例1991年3月至2017年5月接受手術治療的肺轉移DTC患者的病變甲狀腺組織石蠟標本，確診時年齡范圍為23～83歲，中位年齡為45歲，其中PTC 39例，FTC 7例，女27例（58.6%），＜55歲34例（73.9%）。根據病歷記錄人口學數據、病理特征（包括單雙側、遠處轉移等）和臨床結果及第8屆美國癌癥聯合委員會（AJCC）建議評估DTC患者的TNM分期。

1.2131I治療及療效判定131I治療主要通過131I釋放β射線破壞殘余甲狀腺癌組織以降低甲狀腺癌轉移及復發的概率。病灶是否攝碘由2位核醫學科副主任醫師根據碘掃圖像作出評價，病灶攝碘率=攝碘患者例數/總例數。131I治療后6個月測定甲狀腺激素抑制狀態下的血清球蛋白水平，治療后6～12個月進行胸部CT檢查[4]，由2位影像科副主任醫師作出診斷。血清球蛋白水平持續下降25%以上，并按照實體瘤的療效評價標準（RECIST）胸部CT檢查顯示轉移灶縮小、減少則提示131I治療有效[5]，131I治療有效率=有效患者例數/總例數。

1.3 標本采集及檢測 46例DTC組織分別由2位病理科副主任醫師通過HE染色獨立作出診斷并選擇有代表性的區域。作3μm厚切片，采用免疫組化Envision二步法檢測TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的表達。切片常規脫蠟，然后二甲苯脫蠟，并在不同濃度的乙醇稀釋液中進行水合；在pH 6.0的檸檬酸緩沖液中微波預處理15 min進行抗原恢復，再用5%H2O2處理切片5 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，然后將切片與CgA（美國Invitrogen公司，MA1-25038）、CD56（美國Invitrogen公司，MA5-11563）、Syn（美國Abcam公司，ab32127）、TSHR（美國Abcam公司，ab218108）、NIS（美國Abcam公司，ab242007）抗體（1：100稀釋）在室溫下孵育1 h；用PBS洗滌3次后，加入二抗（美國Santa Cruz公司，羊抗鼠sc-2005，鼠抗兔sc-2357，1：2 000稀釋）在室溫下孵育20 min。所有切片用DAB顯色5 min，然后用蘇木素復染，并由2位病理科副主任醫師復查。

1.4 結果判定 根據免疫組化染色強度和陽性細胞百分率評估TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的半定量表達水平。未染色、淺黃、黃棕色和棕色的染色強度評分分別為0、1、2和3。陽性細胞百分率分別為0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%和＞75%，評分分別為0、1、2、3和4。將染色強度評分和陽性細胞百分率評分乘積代表CgA、CD56、Syn、TSHR、NIS的半定量表達水平，＜4分為陰性表達，≥4分為陽性表達[6]。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計數資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 相關基因表達與臨床特征的關系 46例患者中131I治療有效率為36.9%（17/46），病灶攝碘率為60.8%（28/46）。NIS、TSHR、CgA、CD56在DTC中的陽性表達率 分 別 為28.2%（13/46）、15.2%（7/46）、8.6%（4/46）、15.2%（7/46）。Syn無陽性表達。CgA、CD56表達水平在不同年齡、性別、單雙側、分期、遠處轉移及療效的DTC患者之間差異均無統計學意義（均P＞0.05）；NIS表達水平在不同年齡DTC患者之間的差異有統計學意義（P＜0.05），而在不同性別、單雙側、分期、遠處轉移、攝碘率及療效的DTC患者之間差異均無統計學意義（均P＞0.05）；TSHR表達水平在不同性別DTC患者之間差異有統計學意義（P＜0.05），而在不同年齡、單雙側、分期、遠處轉移、攝碘率及療效的DTC患者之間差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 相關基因表達與臨床特征的關系（例）

2.2 CgA、CD56表達與NIS、TSHR表達的關系 CgA與TSHR、NIS表達之間差異無統計學意義（P＞0.05）。CD56陽性患者中NIS陽性率為38.5%（5/13），高于CD56陰性的6.9%（2/29），差異有統計學意義（P＜0.05），而CD56陽性與陰性患者TSHR表達率的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CgA、CD56表達與NIS、TSHR表達的關系（例）

3 討論

目前甲狀腺癌的DTC發病率較高，經過手術、甲狀腺激素抑制治療及131I治療后大部分患者預后良好[7]。本研究中大部分患者病灶能夠攝取131I，并且大部分攝碘患者療效較好，與相關報道相符[8]。但部分患者存在遠處轉移且不可手術切除的病灶對131I治療抵抗，患者預后不良，相關機制仍需要進一步的研究[9]。腫瘤進展過程中組織存在NED，將對常規的放化療等治療手段產生抵抗。已有研究證明肺癌及前列腺癌存在NED并與患者的放化療療效和預后之間有統計學差異[10-11]，而DTC中是否存在NED鮮有文獻報道。

評價是否存在NED的基因主要有Syn、CgA、CD56。Syn是與突觸結構和功能密切相關的膜蛋白，在神經內分泌細胞中Syn可作為一種非特異的神經內分泌標志物[12]；CgA是一種位于嗜鉻性顆粒內的親水性分泌蛋白，是良好的腫瘤進展標志物，具有調節機體神經內分泌免疫網絡的功能[13]；CD56是一種表達于甲狀腺濾泡上皮細胞和腎上腺的同型膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在神經系統中發揮重要作用，與多種腫瘤的進展和轉移相關[14]，在腫瘤細胞發育和分化過程中參與細胞與細胞之間的相互作用以及細胞與基質之間的相互作用，調控細胞的遷移。因此本研究將納入分析CgA、CD56、Syn作為NED標志物在病理組織中的表達情況，其中任何一個陽性即認為有NED特征。本研究中CgA、CD56、TSHR、NIS在甲狀腺癌中均有陽性表達，Syn無陽性表達。

NIS和TSHR是參與甲狀腺碘代謝的重要蛋白。DTC術后甲狀腺激素抑制治療及131I治療的理論依據均與NIS和TSHR的表達有關。TSHR是促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受體，其將TSH刺激信號傳遞到甲狀腺上皮細胞內，啟動NIS等碘代謝基因的表達，促進甲狀腺濾泡上皮細胞攝取碘并完成甲狀腺激素的合成，對細胞的碘代謝具有重要意義[15]。DTC保留了甲狀腺濾泡上皮細胞對碘的代謝功能，病灶可特異性濃聚碘，因此給予患者發射β射線的放射性131I可以達到治療轉移灶的作用。TSHR和NIS的表達對患者病灶是否攝碘及療效有重要意義。相關研究表明，DTC中NIS表達降低且在細胞質和細胞膜的定位與BRAFV600E突變有關，與性別、年齡、腫塊大小、分期等臨床特征均無關[16]。TSHR表達與腫塊大小有關，與其它臨床特征均無關。本研究表明，不同性別患者中TSHR表達的差異有統計學意義，其它臨床特征的差異均無統計學意義；NIS的表達與年齡差異有統計學意義，與其它臨床特征的差異均無統計學意義。本研究中CgA、CD56的表達與臨床特征均無統計學意義，相關研究在國內外鮮有報道。

由于NED基因是否影響TSHR和NIS表達的研究較少。因此，本研究統計分析CgA、CD56、Syn表達與TSHR和NIS表達之間的關系。NIS表達是決定131I治療療效的關鍵因素，結果顯示CD56表達與NIS表達之間差異有統計學意義。有研究顯示CD56在正常甲狀腺、PTC、濾泡性腺瘤中都有不同程度的表達，但在PTC癌組織中表達陽性率低于癌旁組織[17]。

綜上所述，131I治療可以使部分肺轉移DTC患者獲益，是DTC術后治療的重要手段。部分DTC組織存在NED，其中CD56表達與NIS表達之間差異有統計學意義。因此，CD56可能對NIS的表達發揮作用，相關機制需進一步研究。由于組織樣本病例數目有限以及免疫組化評價方法的局限，研究結果仍然需要進一步的研究確認。