異檸檬酸脫氫酶基因突變的彌漫性較低級別膠質瘤中α地中海貧血伴智力低下綜合征基因缺失與1p/19q聯合缺失的表達分析

王君祥 孫成法 褚榮濤 姜 華 龔銘杰 周幽心 李學濤

1.徐州醫科大學附屬常熟醫院暨常熟市第二人民醫院神經外科，江蘇蘇州215500；2.蘇州大學第一附屬醫院神經外科，江蘇蘇州215006

膠質瘤是成人最常見的原發性顱內腫瘤，惡性程度不一。世界衛生組織最新的關于中樞神經系統的腫瘤分類將膠質瘤分為4級，其中多形性膠質母細胞瘤稱為4級膠質瘤，惡性程度最高，而2～3級彌漫型膠質瘤（包括彌漫性星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、少突膠質瘤和間變性少突膠質瘤）可稱為彌漫型較低級別膠質瘤[1]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突變能更好地評價類似組織學分型腫瘤的預后，但對于同樣IDH分型的較低級別膠質瘤，利用相關基因變異如α地中海貧血伴智力低下綜合征基因（X-linked alpha thalassemia mental retardation syndrome gene，ATRX）缺失或1號染色體短臂和19號染色體長臂（1p/19q）共缺失判斷其亞型及預后的相關領域尚待深入研究[2-3]。

本研究的目的是評價ATRX缺失和1p/19q聯合缺失在IDH突變的較低級別彌漫性膠質瘤患者中判斷其亞型及評價其預后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

IDH突變型成人較低級別彌漫性膠質瘤患者142例，選 自2012年6月 至2017年6月 確 診并在蘇州大學附屬第一醫院和常熟市第二人民醫院手術及放化療治療的病例。其中平均隨訪時間40個 月（10～88個 月），男77例，女65例，年 齡30～62歲。包括彌漫性星形細胞瘤55例、間變性星形細胞瘤45例、少突膠質細胞瘤22例、間變性少突膠質細胞瘤20例，依據組織學分型分為星形細胞瘤與少突膠質細胞瘤兩組。組織病理學診斷符合2015WHO中樞神經系統腫瘤分類標準[2]。納入標準：①成人初次發病；②術后病理確診為彌漫型較低級別膠質瘤；③分子檢測IDH陽性。排除標準：①復發性膠質瘤；②10個月內失訪。本研究研究對象均知情同意并簽署知情同意書，研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 膠質瘤ATRX缺失的檢測

切片脫蠟后滴加ATRX多克隆抗體[Sigma-Aldrich公司（美國），HPA001906，1∶2000]，按照Envision二步法染色。陰性對照以緩沖液代替一抗進行孵育，細胞核棕褐色為陽性表達。免疫組織化學陽性判讀標準：于每張切片挑選染色均勻5個不相鄰高倍視野（×400），計數每視野內陽性細胞個數，并計算陽性細胞百分率。以ATRX陽性細胞數＞10%定義為陽性（ATRX表達），以陽性細胞數≤10%定義為陰性（ATRX表達缺失）[4]。所有試驗都包括陽性對照樣本及陰性對照以確保染色質量。

1.3 1p/19q聯合缺失的熒光原位雜交（FISH）

FFPF切片上使用Abbott Molecular，Inc.的兩組雙色探針，探針組（A）：LSI 1p36（TP73/MEGF6，spectrum orange）/1q25（ANGPTL1/ABL2，spectrum green）；探 針 組B：LSI 19q13（ZNF44/ZNF443/MAN2B1，spectrum green）/19p13（GLTSCR2/CRX，spectrum orange）。每組探針計數200（200）個細胞，缺失1p或19q（1個紅、2個綠信號）≥50%，或缺失1p36/1q25和19q13/19p13的信號比≤0.8，則提示1p或19q缺失[5]。

1.4 觀察指標

①基于兩組患者ATRX缺失與1p/19q缺失情況，比較其與組織學分型之間相關性。②術后第1年每3個月隨訪1次，隨后每6個月隨訪1次，隨訪截止時間為2020年6月，平均隨訪時間40個月（10～88個月）。生存時間（OS）定義為診斷到患者死亡或最后1次隨訪之間的時間。比較兩組患者中位生存時間與ATRX缺失及1p/19q聯合缺失之間的關系。

1.5 統計學分析

使用SPSS 20.0進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗，評價各參數間相關性的顯著性。Kaplan-Meier法估計生存率與ATRX缺失及1p/19q聯合缺失之間的關系，采用log-rank檢驗進行評估。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IDH突變彌漫性低級別膠質瘤中ATRX缺失與1p/19q聯合缺失患者情況

共檢測142例成人IDH突變型彌漫性低級別膠質瘤患者，患者一般資料見表1。

表1 IDH突變彌漫性低級別膠質瘤中ATRX缺失與1p/19q聯合缺失患者情況

2.2 兩組ATRX表達缺失情況比較

免疫組織化學檢測發現55.6%（79/142）的腫瘤患者有ATRX表達缺失。其中彌漫性星形細胞瘤43例，間變性星形細胞瘤35例，少突膠質細胞瘤1例。星形細胞瘤組中ATRX缺失顯著高于少突膠質細胞瘤組，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.001），見表2及圖1a、b。

表2 兩組病例ATRX缺失情況比較[n（%）]

2.3 兩組1p/19q聯合缺失情況比較

FISH分析顯示，22.5%（32/142）的腫瘤患者存在1p/19q聯合缺失。其中少突膠質細胞瘤17例，間變性少突膠質細胞瘤15例。星形細胞瘤和間變星形細胞瘤未檢測到1p/19q聯合缺失。少突膠質細胞瘤組1p/19q聯合缺失顯著高于星形細胞瘤組，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.001），見表3及圖1c、d、e、f。

表3 兩組病例1p/19q聯合缺失情況比較[n（%）]

圖1 彌漫性低級別膠質瘤免疫組化及FISH結果（×400）注：a：星形細胞瘤，ATRX野生型；b：星形細胞瘤，ATRX缺失；c：星形細胞瘤，1p正常；d：少突膠質細胞瘤，1p缺失；e：星形細胞瘤，19q正常；f：少突膠質細胞瘤，19q缺失

2.4 ATRX缺失和1p/19q聯合缺失對預后的影響

星形細胞瘤和間變性星形細胞瘤中，ATRX缺失的患者比野生型ATRX的患者生存時間更長，中位生存時間分別為46個月和40個月。同樣，少突膠質細胞瘤患者和間變性少突膠質細胞瘤中1p/19聯合缺失的患者預后明顯優于1p/19q未缺失的患者，中位生存時間分別為53個月和42個月。差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2～3。

圖2 彌漫性星形細胞瘤及間變性星形細胞瘤中不同ATRX表達患者的生存曲線

圖3 少突膠質細胞瘤與間變性少突膠質細胞瘤中不同1p/19q表達患者的生存曲線

3 討論

ATRX是SWI2/SNF2 DNA解旋酶家族中的一員，在染色質調控和端粒維護中發揮著重要作用[6]。ATRX突變與1p/19q聯合缺失互斥，但與p53突變相關，提示ATRX可能驅動星形細胞瘤的譜系特異性形成[7]。在少突膠質細胞瘤中19q缺失及1p缺失較為常見，并且這些缺失經常同時發生[8]。1p和19q的缺失被認為是一個決定性的預測化療反應和生存率的因素。目前認為1p/19q聯合缺失是預后良好的相關因素[9]。

IDH突變已成為2016年WHO中樞神經系統腫瘤分類中的獨立分類因子[1]。既往研究表明，IDH突變在膠質瘤尤其是彌漫性較低級別膠質瘤中起重要作用[10]。而在IDH突變的彌漫性較低級別膠質瘤中，ATRX缺失或1p/19q聯合缺失是否具有類似作用尚待進一步研究。本研究共檢出79例ATRX缺失，絕大部分為星形細胞瘤，僅有1例為少突膠質細胞瘤。星形細胞瘤組中ATRX缺失率顯著高于少突膠質細胞瘤組，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。同時，本研究檢出1p/19q聯合缺失32例，均為少突膠質細胞瘤。少突膠質細胞瘤組1p/19q聯合缺失率顯著高于星形細胞瘤組，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。這表明，上述基因突變具有較高的腫瘤特異性，可以用來鑒別星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤。基于這些基因突變的分子進行分類可能比組織學分類更準確[11]。它們還可以用于糾正一些組織學分型中的一些誤差。正如Kim等[12]所指出的，本研究中存在ATRX缺失的“少突膠質細胞瘤”更適合診斷為星形細胞瘤。

一些研究指出，具有IDH突變的彌漫性較低級別膠質瘤的療效優于野生型的同級別膠質瘤[13-14]。但是同樣IDH突變的患者，其預后影響因素尚待進一步研究。本研究表明，雖然發病年齡相近，ATRX缺失的較低級別星形細胞瘤患者的中位生存時間比ATRX野生型患者要長，中位生存時間分別為46個月和40個月，差異有統計學意義（P＜0.05）。這意味著在星形細胞瘤中，盡管組織學分型相似，ATRX缺失的腫瘤患者預后較ATRX野生型更優。類似的，在少突膠質細胞瘤患者中，盡管組織學分型相似，1p/19q聯合缺失的腫瘤患者預后較1p/19q野生型更優，中位生存時間分別為53個月和42個月，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，在IDH突變的彌漫性較低級別膠質瘤中，即使腫瘤組織學分級不同，ATRX缺失和1p/19q聯合缺失也可以作為這些腫瘤的獨立預后因素。此外，如果對這些基因突變有快速的檢測方法，針對這些腫瘤的綜合治療包括手術切除、放療和化療等，都可以得到更準確的治療及評價手段。

已有研究指出基因靶向治療對IDH突變的膠質瘤患者有良好的治療效果[15]。針對ATRX和1p/19q的基因靶向治療也有望在未來改善膠質瘤的預后。