扶正屏風合劑煎煮工藝與薄層色譜質控研究

宋治榮 王耀鵬 楊錫倉 張兆芳

甘肅中醫藥大學附屬醫院炮制工程中心，甘肅蘭州 730020

扶正屏風合劑源于防治新冠肺炎的甘肅“扶正避瘟方”，該方由黃芪、麩炒白術、麩炒蒼術、防風、生姜、連翹、荷葉七味中藥組成[1]，具益氣固表、扶正辟瘟功效[2]，方中黃芪益氣升陽扶正為君藥；蒼白二術健脾益氣，助黃芪固表實衛為臣藥；佐以防風、生姜走表而祛風邪止咳嗽，連翹、荷葉宣熱化濕以醒脾，又防諸藥辛散太過耗氣傷津。方藥補散結合，扶正以達祛邪，祛邪亦可扶正，寒熱同治以達“陰平陽秘、精神乃治[3]”。研究表明該方具激活免疫調節功能，抵御病毒入侵[2]。開發集湯劑特色的扶正屏風合劑用于新冠肺炎防治，可發揮中醫藥防治“疫病”的優勢。湯藥出膏量是全成分濃縮體[4]，為保證該合劑與湯藥質量及療效一致性，本課題采用干膏率作為全成分評定指標，用正交設計優化煎煮提取工藝，并對方中主要藥味黃芪、防風和連翹進行薄層色譜鑒別，為其質量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）；電子分析天平（FA-2104型，上海良平儀器儀表有限公司）；ZF9型四用紫外分析儀（上海康華生化儀器制造有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（101/102系列，北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

黃芪、麩炒白術、麩炒蒼術、防風、生姜、連翹、荷葉七味均購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經甘肅中醫藥大學附屬醫院楊錫倉主任中藥師鑒定；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717），連翹苷對照品（批號：110821-201816），防風對照藥材（批號：120947-201810），均由中國食品藥品檢定研究院提供；其他試劑均為分析純。扶正屏風合劑三批中試樣品（批號：20200216、20200217及20200220）。

2 方法與結果

2.1 煎煮提取工藝

2.1.1 干膏率測定 精密量取濃縮液10 ml，置于已干燥至恒重的蒸發皿中蒸干，于105℃干燥至恒重，計算干膏得率。

2.1.2 正交設計方案及結果 按處方比例稱取全處方中藥飲片9份，每份重63 g。對影響煎煮提取的主要因素加水量A、煎煮時間B、煎煮次數C，采用L9（34）正交試驗，因素與水平設計見表1。按照試驗方案，首次提取飲片浸泡30 min，再煎煮提取，煎煮液濃縮至100 ml，測定干膏率，試驗結果見表2。

表1 因素與水平

表2 正交試驗結果

2.1.3 實驗結果分析 由表3方差結果可知，A、B、C因素對煎煮效果均有顯著性差異。從表2極差結果可知，各因數影響大小的順序為A＞B＞C，因素A極差K2是高值，因素A選擇A2；因素B、C最高K值是K3，但B因素的K3、K2在同一水平差異不顯著，成本原理出發因素B選B2，C因素極差K3是高值，因素C選C3，得工藝A2B2C3，又因試驗次數C屬次重要因素，而湯藥及水煎煮中藥劑一般2次[5]追加正交試驗A2B2C2驗證，比較A2B2C3與A2B2C2所得出膏率與均值RSD小于5%，綜合生產、經濟等綜合因素出的最優提取條件為A2B2C2，即加水8倍量，煮前先浸泡30 min，煎煮提取2次，每次45 min。

表3 正交試驗結果方差分析

2.1.4 追加工藝驗證試驗 按處方量稱取藥材三份，依照A2B2C2煎煮工藝條件進行追加驗證，見表4。追加試驗結果表明，A2B2C2的煎煮工藝穩定可靠。

表4 煎煮工藝驗證實驗結果

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 黃芪的薄層鑒別[6-8]取扶正屏風合劑20 ml，用水飽和正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇層，加氨試液洗滌4次，每次20 ml，棄去氨試液層，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法處理，作為陰性對照品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13︰7︰2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃環境中加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點；紫外光燈（365 nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點，陰性無干擾。見圖1～2。

圖1 黃芪薄層鑒別色譜圖

圖2 黃芪薄層鑒別色譜圖

2.2.2 防風的薄層鑒別[6]取扶正屏風合劑20 ml，用水飽和正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取缺防風的陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法處理，作為陰性對照品溶液。另取防風對照藥材1 g，加水20 ml回流1 h，過濾，濾液用水飽和正丁醇煎煮2次，每次20 ml，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4︰1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾（圖3）。

圖3 防風薄層鑒別色譜圖

2.2.3 連翹的薄層鑒別[6，9]取扶正屏風合劑20 ml，用水飽和正丁醇煎煮2次，每次20 ml，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法處理，作為陰性對照品溶液。另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 ml含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（6︰1︰0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃環境中加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾（圖4）。

圖4 連翹薄層鑒別色譜圖

3 討論

中醫認為新冠肺炎為“濕性濁毒”，屬“疫癘之邪”的范疇，目前在治療上無特效藥，而中醫藥防治疫病的思想和方藥經驗在新冠肺炎防治方面取得效果，中醫藥作為國家防治新冠肺炎戰略推廣應用[10]。甘肅根據“因時、因地、因人”三因制宜原則，發揮中醫藥“治未病”優勢，防治“疫病”在早期思想，中醫藥深度介入新冠肺炎預防、救治、康復全過程，凝練形成系列有效方藥[11]，其中扶正屏風合劑方是防治新冠肺炎的“甘肅方劑”之一，在新冠肺炎防治方面得到了廣泛應用，并取得良好效果[12]。發揮中醫藥的“簡便驗廉”防治疾病優勢，為進一步推廣使用中藥制劑，滿足防疫需求，本研究在湯藥“一人一方”基礎上，對該方進行提取工藝規范化研究，開發成與湯液等效的扶正屏風合劑，便于臨床使用和質量控制[13]。扶正屏風合劑的研發過程，體現中醫“治未病”思想，中醫藥在“疫病”防治中應早；對素體偏虛、易于外感的人群服用扶正屏風合劑實現《黃帝內經》“正氣存內、邪不可干”的目的，體現中醫“扶正祛邪”思想和“關口前移、截斷扭轉”的治病理念；扶正屏風合劑方的形成是在中醫學理論防治疫病的探索和經驗總結，應對呼吸傳染病防治中醫藥盡早介入的新思路。

由于中藥本身所含化學成分復雜，加之復方配伍過程中又有新物質產生[14]，用某一成分或組分難以代表藥效，而復方中藥的藥效是各組成分協同作用的體現[15]，現發現扶正屏風合劑處方藥味中主要活性成分有槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、蒼術酮、茅蒼術醇、連翹苷A等84個[4，16-17]，藥效物質具有綜合整體性特征[18]，從中醫整體觀出發，本研究選干膏率為評價指標，因干膏量代表全成分濃縮體，體現多成分原則[4]，選干膏率合理可行。通過實驗研究，優選煎煮提取工藝為煮前先浸泡30 min，煎煮提取2次，每次加8倍量水，每次45 min，與湯藥對照合劑體現高濃度小劑量的特色。

研究中對質量控制采用薄層色譜方法，選取的指標均是主要藥效成分。經過多次試驗篩選，蒼術、白術同科屬近原植物，藥效成分相似相互干擾無法檢出[19]，選擇黃芪、連翹中特有指標成分黃芪甲苷[20]、連翹苷[21]，防風鑒別指標選擇防風對照藥材[22]，實驗建立的薄層色譜條件專屬性強，重現性好，能控制合劑質量。

但由于扶正屏風合劑為復方，其中藥化學成方的復雜性，目前難以用單個或某個藥效物質解釋全方藥理作用機制，僅用概括性的干膏率參照評價，評價指標的模糊性難以闡述藥效機制為不足，后期將繼續不斷在累積臨床療效數據基礎上，開展多指標多通道多靶點藥效作用機制研究，用現代分析和統計技術制訂多批次標準湯藥多成分評價標準，用標準湯藥一致的合劑質量標準解釋藥效指導臨床安全用藥，避免制訂的質量指標與療效相脫節。

綜上所述，中藥是防病治病的物質基礎，離不開中醫理論指導和實踐檢驗。中醫臨床驗方開發，必須始終遵行中醫理論指導，制訂的制劑工藝質量標準直接關乎臨床療效，利用色譜技術用已知成分的量做參考，峰面積大小量化未知物質的相對含量，實現多指標成分控制制劑質量，對映中藥多靶點途徑闡述藥效物質基礎，現有指紋圖譜分析技術的選擇，可再現質量指標與中醫臨床療效統一。