紫外分光光度法測定皂布葉中總蒽醌含量

張 婷 劉安韜▲ 劉喜華 盧月妹

1.廣西衛生職業技術學院藥學系，廣西南寧 530023；2.右江民族醫學院，廣西百色 533000

皂布葉為鼠李科植物尼泊爾鼠李[Rhamnus napelensis（Wall.）Laws.]的全株，主治風濕關節痛、慢性肝炎、肝硬化腹水等病癥[1]，劉安韜等[2]對皂布葉的研究表明，皂布葉有良好的抗痛風作用。皂布葉中主要成分為蒽醌類化合物[3]，但目前未見皂布葉蒽醌類化合物的測定方法，本文采用醋酸鎂-甲醇顯色法，建立了超聲提取-分光光度法測定皂布葉中總蒽醌含量的方法，為該藥材的質量研究和產品開發提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

普析通用TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），KQ2200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DFT-100高速粉碎機（大德藥械有限公司），賽多利斯分析天平BSA8201[賽多利斯（上海）貿易有限公司]，XS204電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]，HH-S2數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）。

1，8-二羥基蒽醌（對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：110829-9702）；醋酸鎂、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均為分析純），均購自成都市科隆化學品有限公司。

共收集了12批次皂布葉樣品，采收于廣西武鳴縣，靖西縣等地，分別編號為1～12號，干燥粉碎后備用。見表1。

表1 皂布葉樣品信息表

1.2 試劑及溶液配制

蒽醌標準溶液（0.1037 mg/ml）：精密稱取10.37 mg 1，8-二羥基蒽醌，至100 ml量瓶，加甲醇適量溶解，用甲醇稀釋至刻度。

醋酸鎂-甲醇溶液（質量分數為0.5%）：稱取2.50 g醋酸鎂溶于500 ml甲醇中，儲于棕色瓶中保存備用。

1.3 樣品溶液制備

精密稱取0.200 g樣品粉末于100 ml錐形瓶中，加入50 ml 50%甲醇，超聲（常溫）提取30 min，放冷，補足重量，過濾。精密量取取25 ml提取液于燒杯中水浴蒸干至約2 min，加入15 ml 3.0 mol/L鹽酸，水浴水解30 min，取出冷卻后，用乙酸乙酯萃取10 ml（5 ml×2），合并乙酸乙酯液蒸干，加甲醇溶解，轉移至25 ml量瓶，加甲醇至刻度。精密量取1 ml至50 ml量瓶，加4 ml醋酸鎂-甲醇顯色，加甲醇至刻度。

1.4 標準曲線的繪制

分別準確吸取蒽醌標準溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml置于50 ml容量瓶中，分別加入醋酸鎂-甲醇溶液4 ml，搖勻顯色，加甲醇定容至刻度，以試劑空白為參比，在230 nm處測定吸光度（A）。以蒽醌質量濃度（C）為橫坐標（μg/ml），吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線并擬合回歸方程，結果見圖1。從圖1可知，醋酸鎂－甲醇法測定總蒽醌的回歸方程為：A=0.78C+0.0419，R2=0.9962，在0.002074～0.01037 mg/ml范圍內線性關系良好。

圖1 標準曲線與回歸方程

2 結果

2.1 測定波長的確定

吸取蒽醌標準溶液1 ml于比色管中，按照“1.4”項下顯色后，于紫外可見分光光度計上掃描吸收曲線?？芍?，最大吸收波長為230 nm，因此，選擇230 nm為測定波長，見圖2。

圖2 吸收光譜

2.2 提取溶劑對提取蒽醌濃度的影響

采用同一批次皂布葉樣品Z4，按“1.3”項下超聲提取法的步驟，考察了不同溶劑類型及溶劑濃度對檢測結果的影響。分別選擇甲醇和乙醇作為提取溶液劑，甲醇對皂布葉總蒽醌的提取效果明顯好于乙醇；通過不同濃度甲醇提取濃度對比顯示，50%甲醇提取的濃度更高，因此，選擇超聲提取的最佳溶劑和濃度為50%甲醇，見表2。

表2 不同溶劑類型及溶劑濃度對提取蒽醌質量濃度的影響

2.3 提取時間及溫度對提取蒽醌濃度的影響

采用同一批次皂布葉樣品Z4，按“1.3”項下超聲提取法的步驟，考察了超聲提取溫度及時間對檢測結果的影響。隨著提取時間的增加，皂布葉中蒽醌濃度有明顯的提高，但提取時間超過50 min后，蒽醌類氧化變色濃度開始明顯下降；提取溫度對于皂布葉中總蒽醌提取濃度影響不明顯。因此，選擇超聲提取的最佳時間為30 min，選擇超聲提取的最佳溫度為40℃，見圖3及表3。

表3 提取溫度對提取蒽醌濃度的影響

圖3 超聲提取時間對提取蒽醌濃度的影響

2.4 顯色劑（醋酸鎂溶液）用量對蒽醌濃度測定的影響

采用同一批次皂布葉樣品Z7，取0.200 g按“1.3”項下超聲提取法的步驟，考察了不同顯色劑用量對檢測結果的影響。不同顯色劑用量對于皂布葉中蒽醌濃度測定有一定影響，在藥材取樣0.200 g時，用醋酸鎂4 ml，測定結果穩定，效果良好。見表4。

2.5 方法學考察

2.5.1 穩定性 取標準曲線中6.22 μg/ml的對照品溶液，照“1.4”項下操作，在230nm波長下，分別在0、2、4、8、10、12、24、48 h測定其吸光度。吸光度RSD值為0.182%，見表5。

表5 穩定考察表

2.5.2 重復性 取2.5.1項0 h溶液，同法測定6次。結果吸光度RSD值為0.0747%。見表6。

表6 重復性考察表

2.5.3 加樣回收率 精密稱取皂布葉樣品Z8，0.202 g，照“1.3”項下操作至精密量取1 ml，至50 ml量瓶，平行制備3份，分別加入0.002074、0.003111、0.004148 mg 1，8-二羥基蒽醌，加4 ml醋酸鎂-甲醇顯色，加甲醇至刻度，同法每份再平行配置兩份。照“1.4”項下測定總蒽醌含量，計算加樣回收率。平均回收率為95.71%，RSD值為1.24%，見表7。

表7 加樣回收率考察表

2.6 樣品含量測定

對12個批次皂布葉樣品（1～12號）進行干燥粉碎后，按“1.3”項下操作，照紫外-可見分光光度法，在230 nm波長下測定，計算含量。皂布葉中總蒽醌的含量最高可達52.44 mg/g，最低為23.08 mg/g，平均含量為37.64 mg/g；對照藥材采收表，皂布葉藥材在9～10月份含量達到較高值，隨著植物開花結果，全株藥材的蒽醌物質含量有下降趨勢，一般在1～2月降到最低，見表8。

表8 12個批次皂布葉樣品總蒽醌含量

3 討論

本研究建立了以超聲提取-鹽酸水解-乙酸乙酯萃取為預處理手段，以醋酸鎂-甲醇顯色測定皂布葉中總蒽醌質量濃度的方法，本方法操作安全、簡單，操作效率高，且精密度好，結果穩定可靠。其中超聲提取法廣泛用于中藥材中總蒽醌的提取[4-6]，通過對影響提取率的溫度、時間[7]、超聲功率[8]和溶劑種類[9-10]、濃度等因素的考察，采用單因素法、正交實驗法或響應面分析法[11-12]優化實驗方案，因此本研究在進行提取方法考查中僅對超聲提取的溫度、時間和提取溶劑等主要條件進行考查，并得到了良好的效果。

醋酸鎂-甲醇法主要針對游離態蒽醌進行顯色測定，提取液中總蒽醌與醋酸鎂的充分結合會明顯影響測定結果，因此本研究考查了醋酸鎂溶液的用量，保證顯色的穩定性，另外溶液中酸的存在也會影響降低吸光度值[13]，因為酸會對蒽醌與鎂離子生成的絡合物穩定性產生影響，所以收集到的乙酸乙酯萃取液一定要用水洗到中性。

皂布葉中化學成分以多酚類為主，其中的蒽醌類成分顯示出良好的抗炎，抑菌和抗氧化等[14-17]藥理活性，本研究以前期皂布葉提取物抗痛風作用[2]為基礎，針對藥材中主要的有效成分蒽醌類化合物建立測定方法研究，皂布葉藥材在9～10月份含量達到較高值，隨著植物開花結果，全株藥材的蒽醌物質含量有下降趨勢，為進一步規范藥材使用，規范藥材質量有一定的現實意義。

采用紫外-可見分光光度法進行含量測定具有較好的專屬性和廣泛的應用范圍，在確定吸收波長條件下可以實現快速偵測。但由于光譜法本身的條件限制，測定樣品的濃度過高會影響測定的準確度，另外會有同吸收峰的物質所干擾，影響準確度。高效液相色譜（HPLC）主要利用物質理化性質上的差異進行分離和定量測定。HPLC專屬性強，準確度更高，但在含量測定中，對樣品的組分的結構、性質的明確性要求較高，測定成分更明確，所需時間長。本研究主要針對皂布葉藥材中蒽醌類成分進行測定，而不是單體成分，測定方法便捷，結果穩定可靠，可以作為皂布葉藥材質量控制的方法。在以后的研究中，課題組將進一步深入研究該藥材的藥效成分，建立專屬性更強的測定方法。