涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測在疑似肺結(jié)核患者臨床診斷中的應(yīng)用

蘭劍鋒 劉淑燕

1.深圳市第三人民醫(yī)院 南方科技大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病國家臨床重點(diǎn)專科，廣東深圳 518112；2.深圳市第三人民醫(yī)院 南方科技大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝病研究所，廣東深圳 518112

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球2018年有1000萬左右結(jié)核病人群，其中90%左右為成年人[1]。結(jié)核病屬于傳染病，其主要由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起，以肺結(jié)核最為常見[2]。當(dāng)前國內(nèi)診斷肺結(jié)核以患者臨床表現(xiàn)、X線檢查結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查[痰涂片抗酸染色法（涂片法）、羅氏培養(yǎng)法（L-J法）]為主[3-4]。但涂片法敏感度較低，MTB培養(yǎng)法耗時(shí)長。因此，十分有必要采取更高效的肺結(jié)核病原學(xué)檢查方法。近些年多種分子生物學(xué)技術(shù)在臨床疾病診斷中的應(yīng)用范圍較廣[5-6]。目前國內(nèi)雖然將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于肺結(jié)核診斷的研究報(bào)道較多，但其尚無統(tǒng)一定論。為此，本研究探究涂片法、L-J法、結(jié)核分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)（MGIT 960法）及GeneXpert MTB/RIF檢測（GeneXpert法）在疑似肺結(jié)核臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月至2020年12月深圳市第三人民醫(yī)院收治的80例疑似肺結(jié)核患者，其中男58例，女22例；年齡18～76歲，平均（41.52±9.37）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①存在低熱、咳嗽、盜汗、咯血等癥狀，或影像學(xué)胸部檢測結(jié)果類似于活動(dòng)性肺結(jié)核表現(xiàn)；②均為首次來院就診；③入組前2年內(nèi)無抗結(jié)核藥物使用史；④患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在心、肝等嚴(yán)重疾病者；②有明確精神疾病者；③正參與其他相關(guān)研究者。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有患者均采集痰標(biāo)本，進(jìn)行涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測。

1.2.1 涂片法 將每份痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，待涂片自然干燥后采取萋-尼抗酸染色，并在顯微鏡下進(jìn)行抗酸桿菌檢查，其檢查方法及結(jié)果判斷以《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]為依據(jù)。本研究所用染色液為山東拓普生物工程有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)S0021；儀器為麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的BA210-T生物顯微鏡，產(chǎn)品編號(hào)V506499。

1.2.2 L-J法 抗污染液化處理痰標(biāo)本后，采集0.1 ml標(biāo)本并將其在羅氏培養(yǎng)基中接種，仔細(xì)觀察培養(yǎng)基狀況，如果有菌落生長則進(jìn)行涂片鏡檢，陽性者即為L-J法檢測陽性。本研究所用改良羅氏培養(yǎng)基為海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品貨號(hào)HB6250-1。

1.2.3 MGIT 960法 以BACTEC MGIT 960系 統(tǒng)操作說明書為依據(jù)進(jìn)行MGIT 960法檢測，采集痰標(biāo)本0.5 ml于50 ml離心管中，再向其中加入NALC-NaOH 1～2 ml，待震蕩處理后加入磷酸鹽緩沖液40 ml進(jìn)行離心，待離心后棄上清液，再加入磷酸鹽緩沖液1 ml進(jìn)行重懸沉淀，最后采集0.1 ml標(biāo)本并將其在備好的培養(yǎng)管中接種。并將儀器顯示陽性的標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢以明確結(jié)核桿菌生長。本研究所用儀器及配套試劑為美國BD公司生產(chǎn)。

1.2.4 GeneXpert法 以GeneXpert MTB/RIF操作說明書為依據(jù)進(jìn)行GeneXpert法檢測，采集痰標(biāo)本1 ml，再向其中加入標(biāo)本處理液2 ml，待震蕩處理15 min后采集2 ml液化標(biāo)本置于反應(yīng)盒中，再將反應(yīng)盒置于檢測儀中進(jìn)行自動(dòng)檢測，檢測結(jié)果可在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察。本研究所用儀器及配套試劑為美國Cepheid公司提供。

1.3 觀察指標(biāo)

以《WS 288-2017肺結(jié)核診斷》[8]標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，比較涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測在疑似肺結(jié)核患者臨床診斷中的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。其中敏感度=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%；特異度=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）×100%；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陽性數(shù)）×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

在80例疑似肺結(jié)核患者中，有41例肺結(jié)核患者，39例非肺結(jié)核患者。

2.2 四種方法單獨(dú)檢測結(jié)果

以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片法檢測出19例陽性，61例陰性，其診斷的敏感度為36.59%（15/41）、特異度為89.74%（35/39）、陽性預(yù)測值為78.95%（15/19）、陰性預(yù)測值為57.38%（35/61）；L-J法檢測出15例陽性，65例陰性，其診斷的敏感度為31.71%（13/41）、特異度為94.87%（37/39）、陽性預(yù)測值為86.67%（13/15）、陰性預(yù)測值為56.92%（37/65）；MGIT 960法檢測出21例陽性，59例陰性，其診斷的敏感度為43.90%（18/41）、特異度為92.31%（36/39）、陽性預(yù)測值為85.71%（18/21）、陰性預(yù)測值為61.02%（36/59）；GeneXpert法檢測出16例陽性，64例陰性，其診斷的敏感度為39.02%（16/41）、特異度為100.00%（39/39）、陽性預(yù)測值為100.00%（16/16）、陰性預(yù)測值為60.94%（39/64）。四種檢測方法檢測敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.349，P=0.718＞0.05）；GeneXpert法檢測特異度比涂片法、L-J法、MGIT 960法高（χ2=9.662，P=0.022＜0.05）。見表1～4。

表1 涂片法檢測結(jié)果與臨床診斷比較

表2 L-J法檢測結(jié)果與臨床診斷比較

表3 MGIT 960法檢測結(jié)果與臨床診斷比較

表4 GeneXpert法檢測結(jié)果與臨床診斷比較

2.3 四種方法聯(lián)合檢測結(jié)果

涂片法+L-J法+GeneXpert法+MGIT 960法聯(lián)合檢測的敏感度（48.78%）最高，特異度（87.18%）最低，但四種方法聯(lián)合檢測的敏感度、特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.866、0.173，P=0.393、0.917＞0.05）。見表5。

表5 四種方法聯(lián)合檢測結(jié)果（%）

3 討論

肺結(jié)核作為一種法定傳染病，其危害人體多種器官，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量[9-10]。肺結(jié)核診斷的主要途徑為MTB檢測，國內(nèi)“十三五”結(jié)核病防治規(guī)劃指出，肺結(jié)核患者病原學(xué)應(yīng)達(dá)到50%陽性率[11]，而2017年國內(nèi)《WS 288-2017肺結(jié)核診斷》中的病原學(xué)檢測范圍新增了MTB液體培養(yǎng)及核酸檢測。因此，尋找更佳的肺結(jié)核診斷方法十分重要。

涂片法為當(dāng)前肺結(jié)核主要檢測方法，其操作簡便，檢測速度快，且易普及[12]。但涂片法要求標(biāo)本中的含菌量較高，故其敏感度較低，單獨(dú)使用不利于臨床診斷。本研究中涂片法診斷的敏感度為36.59%（15/41）、特異度為89.74%（35/39），與王蔚等[13]報(bào)道的敏感度為36.41%、特異度為91.52%結(jié)果相似，均表明涂片法單用敏感度較低。眾多學(xué)者認(rèn)為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為MTB培養(yǎng)，如L-J法、MGIT 960法。L-J法培養(yǎng)的檢出率雖高，但其耗時(shí)長，不利于肺結(jié)核的早期診斷，且該法操作繁瑣，操作過程中有污染風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致結(jié)果呈假陰性，易加重患者病情[14]。本研究中，L-J法診斷的敏感度為31.71%（13/41）、特異度為94.87%（37/39），提示L-J法診斷肺結(jié)核的敏感度較低，特異度較高。MGIT 960法最早為美國BD公司提出，相比L-J法，其優(yōu)化接種前操作步驟（如中和離心集菌等），進(jìn)而提高M(jìn)TB培養(yǎng)陽性率，同時(shí)其去污染試劑更溫和高效，并且其將熒光底物加入專用培養(yǎng)管中，方便觀察細(xì)菌生長，進(jìn)一步縮短結(jié)果判斷時(shí)間[15-16]。代小偉等[17]報(bào)道，MGIT 960法診斷肺結(jié)核患者的敏感度為43.2%，特異度為95.1%。本研究中，MGIT 960法診斷的敏感度為43.90%（18/41）、特異度為92.31%（36/39），其檢測的敏感度最高，與上述研究一致。早在2010年世界衛(wèi)生組織即推薦使用GeneXpert法進(jìn)行MTB檢測，該法主要為半巢式定量PCR診斷技術(shù)，其將rpoB基因利福平耐藥核心區(qū)間的81 bp片段作為靶序列，以檢測其是否發(fā)生突變[18]。GeneXpert法能夠在2 h內(nèi)迅速得出檢測結(jié)果，判斷MTB及利福平的耐藥性，有助于雙重感染患者的早期抗結(jié)核治療[19]。本研究中，GeneXpert法判斷的敏感度為39.02%（16/41）、特異度為100.00%（39/39），其檢測特異度比涂片法、L-J法、MGIT 960法高，與周喜桃等[20]報(bào)道相似，提示GeneXpert法診斷肺結(jié)核特異度極高。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，將不同實(shí)驗(yàn)室檢查方法進(jìn)行聯(lián)合檢測可以提高檢測敏感度[21]。為此，本研究以本院實(shí)際情況為依據(jù)，將涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法四種檢測方法進(jìn)行三種組合的聯(lián)合檢測。本研究結(jié)果顯示，涂片法+L-J法聯(lián)合檢測的敏感度為34.15%，比單獨(dú)應(yīng)用涂片法檢測的敏感度低；涂片法+L-J法+GeneXpert法聯(lián)合檢測的敏感度為43.90%，高于三種方法單獨(dú)檢測的敏感度；涂片法+L-J法+GeneXpert法+MGIT 960法聯(lián)合檢測的敏感度高達(dá)48.78%，提示四種方法聯(lián)合檢測可以顯著提高診斷的敏感度。但四種檢測方法聯(lián)合檢測的敏感度、特異度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本研究樣本量較少有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為MGIT 960法不僅操作繁雜，還對(duì)操作人員及操作環(huán)境有較高要求，不適用于臨床大范圍開展。另外，有學(xué)者認(rèn)為在結(jié)核病病原學(xué)檢測中，應(yīng)將傳統(tǒng)涂片法與培養(yǎng)法剔除，采用MGIT 960法、GeneXpert法等代之。本研究認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)室檢測條件不同，各種檢測方法的地位亦不同，故其不可相互取代；并且MGIT 960法亦有自身優(yōu)點(diǎn)，如耗時(shí)短、陽性標(biāo)本可供后續(xù)研究等，故有條件的實(shí)驗(yàn)室可積極開展；同時(shí)涂片法、L-J法、GeneXpert法、MGIT 960法可以聯(lián)合檢測以最大優(yōu)化診斷效能，提高檢出率，減少或避免漏診，更好為患者服務(wù)。

綜上所述，涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測在疑似肺結(jié)核患者臨床診斷中的應(yīng)用效果較好，其中MGIT 960法檢測的敏感度最高，GeneXpert法檢測的特異度最高，而四種方法聯(lián)合檢測可以有效提高檢測的敏感度。