非常規酵母細胞工廠合成天然產物

葉敏 高教琪 周雍進

（1. 中國科學院大連化學物理研究所生物技術研究部，大連 116023；2. 大連市能源生物技術重點實驗室，大連 116023）

天然產物是一類來源于微生物或植物中具有活性的次級代謝產物，具有多種生物學功能，特別在抗癌、抗菌、抗炎癥上發揮了關鍵作用，是藥物的重要組成部分［1］。隨著人們需求不斷增加，迫切需要經濟、可持續的大規模工業化生產供應。近年來，合成生物學與系統生物學等技術快速發展，使得利用微生物細胞工廠合成高附加值天然產物有望成為一種有效的替代方式。遺憾的是，目前大多關于天然產物生物合成的研究仍停留在實驗室層面上，如何平衡外源代謝途徑和內源網絡提高生物合成效率仍然面臨著巨大挑戰［2］。

目前，最常用底盤細胞是模式生物大腸桿菌、釀酒酵母，其清晰的遺傳背景和成熟的操作工具、調控手段等使得其廣泛用于天然產物合成［3-5］。然而，大腸桿菌難以表達真核酶如P450，而釀酒酵母偏好生產乙醇影響產物得率。此外，二者需要溫和生存條件，且底物利用范圍有限，特別是近年來第三代原料生物轉化倡導利用廉價的一碳資源［6］，因此迫切需要拓展宿主范圍。

近年來，非常規酵母由于其獨特優勢獲得越來越多的關注。非常規酵母主要是指釀酒酵母和裂殖酵母以外的其他酵母，常見的包括解脂耶氏酵母、巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母等。而利用非常規酵母作為細胞工廠已經應用于合成多種產物［7］，特別是羧酸化合物［8］與生物燃料等［9］。非常規酵母在發酵條件耐受性、廣譜底物利用能力、高密度發酵上具有突出優勢［10］；此外，基因編輯技術和平臺的不斷發展［11］，為非常規酵母細胞工廠構建提供了強有力技術支持。

本文系統總結非常規酵母合成天然產物（特別是萜類和黃酮類化合物）的研究進展，介紹了相關代謝工程改造手段和策略；并與模式微生物進行對比分析其作為細胞工廠的優劣勢；最后介紹非常規酵母基因操作平臺的發展及其合成更復雜生物堿等天然產物的潛力，并展望其未來發展的挑戰和機遇。

1 非常規酵母

模式微生物如釀酒酵母具有清楚的遺傳背景和成熟的遺傳操作平臺，在天然產物合成上取得了良好的進展［12-13］。然而，釀酒酵母面臨耐受溫度、有機溶劑的適應范圍窄［10，14］，可利用底物有限［14］等不足。另一方面，釀酒酵母Crabtree效應使得高密度發酵存在困難（圖1）。尋求和開發其他酵母細胞，有望拓展酵母細胞工廠的應用潛力。

圖1 釀酒酵母和非常規酵母優缺點比較Fig.1 Comparison between Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeasts

非常規酵母一般指除了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）以外的其他酵母。目前研究最為廣泛的非常規酵母是解脂耶氏酵母，其具有相對全面的基因組注釋，因此更易于進行基因操作，在β-胡蘿卜素類化合物、白藜蘆醇、柚皮素生物合成上表現優越，超越了釀酒酵母中取得的產量。解脂耶氏酵母作為產油酵母，其優勢在于細胞質中乙酰輔酶A和NADPH供給充足，有利于下游產物合成，其胞內脂質體能為長鏈疏水天然產物合成與儲存提供疏水環境［15］；特別是，解脂耶氏酵母能夠以長鏈疏水脂肪酸作為唯一碳源，實現廉價原料的高效轉化［16］；并且和模式生物相比表現出較強的耐受性［17］。然而，解脂耶氏酵母生理特性的研究沒有釀酒酵母深入，其培養大多采用豐富培養基［17-18］，成本較高；此外，解脂耶氏酵母在合成更為復雜的天然產物如黃酮和生物堿的報道較少，可能是其外源途徑的構建及與內源代謝的適配充滿挑戰。

除解脂耶氏酵母外，還有系列非常規酵母具備多種優良特性，有望成為構建細胞工廠的優良宿主［19］。比如：甲醇酵母（巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母等）能夠以甲醇作為唯一碳源，而甲醇的同化需要木酮糖-5磷酸（Xu5P）循環［20-21］，因此其合成途徑磷酸戊糖支路（PPP）效率很高，能夠供應更多PPP中間體和NADPH，可能有利于黃酮類等天然產物的合成；漢遜酵母和畢赤酵母還都是工業上外源蛋白表達宿主，具有更類似高等生物蛋白翻譯后修飾能力［22］，對于外源酶的表達更有利；此外，漢遜酵母還能夠耐受40℃以上的高溫［23］，在工業發酵上能夠節約冷卻成本。還有乳酸克魯維酵母、樹干畢赤酵母，分別能夠利用乳糖、木糖；紅發夫酵母具備天然蝦青素合成能力，這些酵母都被GRAS認證且能夠進行高密度發酵［14］，具備合成多種天然產物的潛力。

盡管如此，目前在天然產物細胞工廠的構建方面，非常規酵母的研究還非常有限，主要原因在于基因操作平臺不夠完善，因而構建復雜天然產物合成途徑相對困難。隨著基因組測序技術、CRISPRCas9基因編輯平臺以及合成生物學元件等的快速發展，非常規酵母將具有越來越大的應用潛力。

2 非常規酵母合成萜類化合物

2.1 萜類化合物合成

萜類是由異戊烯基為單元合成，包括單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、三萜（C30）、四萜（C40）等，這一大類化合物通常包含抗癌、消炎、鎮痛等藥用效果，也常在化妝品、調味品、香精香料或食品中添加來修飾產品的色、香、味。萜類化合物是目前以非常規酵母作為細胞工廠研究最為廣泛的天然產物。

酵母體內存在天然萜類合成途徑——甲羥戊酸（MVA）途徑，通過表達不同外源萜類合酶能夠實現多種化合物合成（圖2）。解脂耶氏酵母是優良的萜類化合物合成細胞工廠（表1），特別在合成諾卡酮、類胡蘿卜素類化合物（C40，包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-紫羅蘭酮和蝦青素）時，其產量甚至超過了模式生物。由于解脂耶氏酵母天然積累油脂，為這些長鏈化合物提供了良好的疏水環境，避免了細胞膜積累從而影響細胞活力［15］。研究表明通過增加細胞質脂肪酸合成能夠促進番茄紅素的積 累［15，24-25］，證實細胞疏水環境對于長鏈萜類合成至關重要。在單萜檸檬烯和倍半萜紫穗槐二烯等的合成上，非常規酵母產量遠遠低于模式生物，可能是因為體內輔因子NADPH和ATP代謝不平衡［26］。另外，在發酵條件上，解脂耶氏酵母通常以復雜培養基（YPD）培養細胞［18，27-28］，增加了生產成本。

表1 非常規酵母及模式生物合成部分萜類化合物（標粗表示非常規酵母）Table 1 Terpenoids biosynthesis by model microorganisms and non-conventional yeasts（Bold ones are non-conventional yeasts）

圖2 甲羥戊酸途徑合成萜類化合物Fig. 2 Mevalonate（MVA）pathway for terpenoids biosynthesis

其他非常規酵母在萜類合成上的研究非常有限，目前，只在畢赤酵母［29-30］、克魯維酵母［31］、假絲酵母［32］等中實現了少數萜類化合物合成，并且由于缺乏遺傳操作平臺，代謝改造策略與最終產量均受到局限。

2.2 改造策略

為了在酵母中實現萜類等天然產物高效合成，需要發展代謝工程策略對細胞代謝進行優化，一般包括優化天然產物本身生物合成途徑、強化前體供應和輔因子、弱化副反應以及區室化等代謝工程策略（表2）。這些代謝工程策略通用性強，適用于多種天然產物合成優化，但是需要根據不同天然產物生物合成機制合理選擇改造策略，實現產物高效合成與細胞生長平衡。

表2 非常規酵母合成天然產物改造策略Table 2 Engineering strategies for biosynthesis of natural products in non-conventional yeasts

2.2.1 MVA途徑關鍵基因調控 HMGR是MVA途徑的關鍵基因，它具有N-基端的內質網跨膜結構域，研究表明只過表達C-基端的催化結構域能夠顯著提高萜類化合物的產量，并且避免降解而更穩定的存在于細胞中［58］。過表達解脂耶氏酵母HMGR［51］和tHMGR［46］使檸檬烯和β-紫羅蘭酮產量分別提升14倍和10倍。假絲酵母中發現截短的tHMGR比HMGR有更好的效果［32］；為了避免氧化還原狀態不平衡，在解脂耶氏酵母中表達彼得里鮑特氏菌NADH依賴的HMGR［18］，能夠使細胞利用含量更多的NADH。ERG12也是關鍵基因，過表達提高了相應萜類化合物的合成［28，51］；另一個重要基因IDI1調控DMAPP和IPP之間的轉化，結合HMGR過表達能夠顯著促進萜類化合物的合成［28，59］。

2.2.2 強化前體和輔酶供應與削弱副反應 乙酰輔酶A是萜類合成的重要前體，其高效供應是萜類高效合成的關鍵之一。在解脂耶氏酵母中，過表達檸檬酸裂解酶ACL1和 ACL2強化檸檬酸裂解提供乙酰輔酶A，結合弱化三羧酸（TCA）循環，將番茄紅素產量提升2-3倍［25］。NADPH是MVA途徑合成的關鍵輔酶，在解脂耶氏酵母中過表達甘露醇脫氫酶提高NADPH供給使角鯊烯積累量提高11%［52］。ERG20是調控不同碳原子數萜類化合物合成的關鍵節點，不同的Erg20突變體能夠傾向性合成不同萜類化合物前體。野生型Erg20p偏向合成FPP，而突變體Erg20pF96W-N127W利于GPP合成［60］，Erg20pF96C能夠直接催化IPP和DMAPP形成GGPP［61］。當以倍半萜為目標產物時，融合表達Erg20～Fpps能夠顯著提升產量［18］，且能減少副產物角鯊烯的積累。

除此之外，為了使代謝流盡可能流向目標產物，需要消除/弱副反應。為了提高目標萜類化合物產量，往往需要弱化胞內甾醇的生物合成，而甾醇是合成細胞生長必需物質的前體，所以只能對副反應進行弱化。常用的方法包括弱化ERG9表達，在解脂耶氏酵母中，采用弱啟動子PERG1，PERG11或截短PERG9的形式弱化ERG9表達，蝦青素的產量提升2-2.5倍［53］；另一可行策略是利用抑制型啟動子，通過誘導物動態調控基因的表達實現副反應動態弱化。這一策略在釀酒酵母中有較多嘗試，包括葡萄糖響應的啟動子PHXT1［62］、甲硫氨酸抑制的啟動子PMET［63］，但是在非常規酵母中可利用的誘導型/抑制型啟動子有限。有報道在解脂耶氏酵母中，嘗試角鯊烯抑制型啟動子PERG1和葡萄糖抑制型啟動子PICL1來弱化ERG9表達［64］，但是對番茄紅素的生產沒有明顯效果；而使用甘油強抑制型啟動子PALK1導致工程菌在甘油培養基中生長受限。這些結果表明啟動子挖掘和表征是非常規酵母細胞工廠的重要研究內容之一。

2.2.3 細胞區室化策略 將萜類合成途徑區室化也能夠有效避免副反應發生，而且能夠有效削弱中間產物與目標產物對細胞的毒害作用。過氧化物酶體是理想的區室化細胞器，一方面其區別于線粒體是細胞呼吸場所，系統改造不會對細胞生長造成負擔；另一方面其中含有充足的乙酰輔酶A和NADPH前體，利于合成萜類化合物，且單層膜系統便于物質穿梭運輸。釀酒酵母中將MVA途徑靶向過氧化物酶體，單萜合成比細胞質途徑提升125倍［33］，角鯊烯產量提高68倍［65］；在畢赤酵母中，將番茄紅素合成基因定位至過氧化物酶體顯著提高番茄紅素產量［43］。實際上，非常規酵母，特別是解脂耶氏酵母和甲醇酵母具有發達的過氧化物酶體，有望成為高附加值萜類化合物合成的理想場所。

如前所述，解脂耶氏酵母中豐富脂質體為長鏈萜類化合物的合成提供了良好的疏水區室化環境。有報道發現抑制β-氧化和糖異生提高脂質體含量后，番茄紅素產量顯著提升，且主要積累在脂質體中［24］；此外過表達脂質體合成關鍵基因DGA1顯著提高了角鯊烯［54］和番茄紅素［15］的合成。需要指出，油脂合成也是以乙酰輔酶A為前體，促進其合成可能與萜類合成競爭前體，因此平衡萜類與脂類合成至關重要。

3 非常規酵母合成黃酮類化合物

3.1 黃酮類化合物生物合成

黃酮類化合物是多酚類次級代謝產物的總稱，它們都具有兩個苯環通過3個碳原子相互連接的結構，即C6-C3-C6。黃酮類化合物因為潛在的抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗衰老等活性備受關注，特別在2003年SARS病毒、2019年爆發的新型冠狀病毒COVID-19治療上，黃酮類化合物被證明具有減輕癥狀的效用［66］。

酵母體內需要引入細菌來源酪氨酸途徑或植物來源的苯丙氨酸途徑，由轉氨酶催化形成對香豆酸后，再經過4-香豆酰輔酶A連接酶4CL合成香豆酰輔酶A，再被柚皮素查爾酮合酶CHS催化合成柚皮素查爾酮，最后被P450酶、糖基化酶等修飾形成多種結構各異的黃酮類化合物（圖3）。由于路徑復雜，目前非常規酵母中僅解脂耶氏酵母實現了黃酮類化合物從頭合成（表3）：表達矮牽牛來源的4CL，CHS，CHI和圓紅冬孢酵母的TAL實現了柚皮素的從頭合成［55］，在此基礎上表達外源P450氧化還原酶CPR、羥基化酶F3H，F3’H，進一步合成了黃杉素和圣草酚。Palmer等［57］構建的解脂耶氏酵母黃酮底盤細胞整合多種聚酮合酶，首次檢測到去甲基姜黃素、（E）-5-（4-hydroxyphenyl）-3-oxopent-4-enoic acid化合物。在解脂耶氏酵母中表達了外源TAL，ACL，VST基因，在添加2 mmol/L酪氨酸的基礎培養基中白藜蘆醇產量達到52.1 mg/L［56］，而在釀酒酵母中表達相同酶在相同培養基條件下產量只有9.5 mg/L［67］，充分證實解脂耶氏酵母具有黃酮化合物高效合成的潛力。雖然多種黃酮化合物在非常規酵母中實現了以葡萄糖為底物的從頭合成（表3），但總體合成效率不高。可能是因為外源酶活力有限，后續高效酶挖掘和酶工程改造可能是研究重點。

表3 非常規酵母及模式生物合成部分黃酮類化合物（標粗表示非常規酵母）Table 3 Flavonoids biosynthesis by model microorganisms and non-conventional yeasts（Bold ones are non-conventional yeasts）

圖3 黃酮類化合物生物合成途徑Fig.3 Flavonoids biosynthetic pathways

3.2 改造策略

黃酮生物合成與萜類生物合成既有相似之處，比如說均需要乙酰輔酶A為前體；也有不同之處，比如黃酮直接前體芳香族氨基酸生物合成調控嚴格、復雜。因此，其代謝工程改造既要參考萜類合成的通用策略，又要根據其生物合成機制設計特異性的改造策略（表2）。

3.2.1 前體供給強化 乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A是黃酮化合物合成的重要前體（圖3），強化其供給將有利于產物積累。分別過表達解脂耶氏酵母的檸檬酸裂解途徑、丙酮酸旁路、丙酮酸脫氫酶（PDH）復合體（去除線粒體定位信號肽），不同程度促進了細胞內乙酰輔酶A供給，并且發現PDH復合體、丙酮酸旁路途徑過表達能夠將脂肪酸合成代謝流流向乙酰輔酶A積累［17］。同時，為了減少油脂積累，增加前體合成，過表達PEX10調控過氧化物酶體促進脂肪酸的β-氧化［57］，提高了黃酮化合物合成能力。另外柚皮素發酵過程中發現pH會顯著降低，推測是乙酸堆積，通過過表達乙酰輔酶A合酶進一步提高了產量［55］。

丙二酸單酰輔酶A由乙酰輔酶A經羧化酶ACC1催化形成。ACC1受到磷酸化調控，在釀酒酵母中通過表達解除調控的突變體ACC1S659A，S1157A，將脂肪酸產量提升了6倍［75］。但是在解脂耶氏酵母中，表達內源野生型ACC1有更好的效果［55］。

3.2.2 合成途徑基因強化 黃酮化合物的直接前體是苯丙氨酸和酪氨酸，而它們的合成受到嚴格的反饋抑制調控（圖3）。在釀酒酵母中，催化第一步PEP和E4P合成DAHP的同工酶Aro3和Aro4是關鍵限速步驟，分別受苯丙氨酸和酪氨酸反饋抑制，將Aro4進行氨基酸點突變K229L能夠消除抑制效應［76］；分支酸異構酶Aro7也是關鍵節點，受酪氨酸反饋抑制，色氨酸激活，突變為Aro7G141S后能夠解除這兩種反饋作用。有報道在解脂耶氏酵母中引入酪氨酸途徑，通過與釀酒酵母同源序列比對，鑒定并表達了解脂耶氏酵母自身突變體Aro4K221L，柚皮素產量提升了4倍［57］。白藜蘆醇合成中，通過表達解脂耶氏酵母自身和釀酒酵母外源的Aro4和Aro7突變體基因，產量提升了2.2倍［56］。

除此之外，合成途徑中其他基因強化也對產量提升至關重要。Lv等［55］過表達ARO1將柚皮素產量提高30%。氨基酸合成的前體是E4P和PEP，這些化合物在以葡萄糖為底物時濃度不高且含量不一致，但是它們作為PPP途徑的中間產物，在利用木糖時含量顯著提高，因此，構建木糖響應的柚皮素合成途徑能夠強化其合成效率［77］：第一個階段以葡萄糖利用為主，組成型啟動子合成途徑發揮作用，48 h后開始利用木糖，這一階段木糖主要起到支持生長的作用，第三階段木糖的消耗轉化為產量積累，在YPD+60 g/L木糖搖瓶培養下，產量達到715 mg/L。

3.2.3 外源基因表達水平調控 外源基因表達強度對產物合成至關重要：過低不利于產物的合成，過高會對細胞造成代謝負擔；此外，上下游基因表達強度不同會使中間代謝物積累，造成細胞毒性。對于黃酮類化合物的合成需要引入較多外源基因，最佳的表達配比最終決定了目標產物的合成效率。在解脂耶氏酵母中，將黃酮合成途徑分為柚皮素合成模塊和下游修飾酶模塊，通過逐一過表達各模塊基因，找出CHS拷貝數為5，CPR和F3H比例為1∶2時產量達到最高［55］。在白藜蘆醇合成時，交換4CL和VST基因的啟動子會導致產量明顯下降［56］，說明改造途徑中代謝流達到平衡狀態至關重要。

目前，在解脂耶氏酵母中對外源基因表達強度的調控均是通過逐一增加拷貝數實現，費時費力，并且蛋白之間存在空間距離會導致中間產物泄露。蛋白支架策略可能是今后調控外源基因表達強度的一個重要研究方向。蛋白支架能夠將酶定位到同一個復合體，并且通過親和肽數目的改變來調節酶表達水平。目前，在大腸桿菌中利用蛋白支架調控釀酒酵母來源的ERG13，HMGR，使得甲羥戊酸的合成水平提高77倍［78］。

4 機遇與挑戰

非常規酵母細胞工廠在萜類和黃酮類化合物等天然產物合成方面已取得系列進展，展現了巨大應用潛力和重要研究價值。但是，和模式生物大腸桿菌、釀酒酵母等相比，仍面臨許多技術瓶頸和亟待解決的關鍵問題，主要表現在精準基因編輯技術和合成生物元件匱乏，生理特性認知不足、代謝網絡調控研究滯后等，解決上述瓶頸問題是實現構建非常規酵母細胞工廠高效合成天然產物的重要前提。

4.1 基因操作平臺構建

非常規酵母缺乏良好的基因組注釋和高效精準的基因編輯工具，限制了大片段基因整合、內源基因敲除、基因功能評估。表1和表3中的代謝工程改造大多采用整合質粒［15-16，29，79］或非同源末端連接技術［18］，可能導致整合位點隨機性較高，基因拷貝數不確定，而且還可能需要較多篩選標記。CRISPR-Cas9技術的快速發展，使非常規酵母實現高效基因編輯成為可能。

CRISPR-Cas9通過剪切特定位點能夠實現精準高效的基因編輯，通過篩選不同來源的Cas9蛋白、調節CAS9和gRNA的表達強度，在多種非常規酵母中實現了平臺構建［80］。但是和釀酒酵母以同源重組為主的修復方式不同，非常規酵母大多以非同源末端連接（NHEJ）形式參與斷裂雙鏈的修復，這種方式會導致基因編輯位點DNA片段隨機插入、缺失、重排［81］，難以實現精準代謝工程改造，使得構建的工程細胞隨機性大。在NHEJ中，Ku70/80組成的蛋白復合體會結合在斷裂雙鏈末端，防止其被降解的同時招募核酸內切酶和連接酶進行修復［81］，而HR介導的修復方式則通過招募Rad51/52等關鍵蛋白發揮作用［82］（圖4）。通過對這些蛋白進行調控，在非常規酵母中顯著提升HR修復效率［83-84］，為基因精確編輯提供技術支撐，并且能夠實現大片段整合及多片段體內重組［83-84］。此外，基因敲除或過表達可能對細胞造成代謝負擔，限制了內源代謝網絡的調控及與外源代謝路徑適配。而CRISPR衍生的基因調控策略CRISPRi（抑制）及CRISPRa（激活）調控系統已在解脂耶氏酵母［85-86］、畢赤酵母［87］等中得到建立，將有助于溫和調控基因表達。

圖4 真核生物中的基因編輯技術及重組機制Fig. 4 Gene editing methods and recombination mechanisms in eukaryotes

另一方面，基因組測序技術的發展，能夠為非常規酵母提供完善的基因組注釋信息。轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等技術從宏觀角度反映工程菌代謝網絡信息，揭示工程菌體內調控模式，為代謝工程改造提供靶點。以甲醇酵母為例，由于對其生理生化特性認識有限，在目前模式生物構建一碳同化效率低［88-89］的背景下，從組學角度出發，可能能夠更好的探索和闡釋一碳同化機制，提高甲醇同化效率，為構建高效甲醇酵母細胞工廠提供指導。

4.2 合成生物學元件挖掘

啟動子和終止子是基因表達的關鍵元件。目前，非常規酵母中最常見的誘導型啟動子包括甲醇嚴格誘導的PAOX1，解脂耶氏酵母銅離子誘導啟動子［90］，脂肪酸強誘導型啟動子［91］等。但是，總體來說，目前非常規酵母相關元件信息十分匱乏，制約了代謝工程改造。后續挖掘不同強度的組成型和誘導型啟動子有助于突破非常規酵母元件限制，為構建高效細胞工廠奠定良好基礎。特別是啟動子能夠從轉錄水平上調控基因表達，對于細胞毒性的天然產物，借助誘導型啟動子將生長與生產分隔開，能夠避免產物過早積累抑制細胞生長。

4.3 代謝物與產物細胞毒性

產物的積累往往對細胞具有毒害作用。除了利用誘導/抑制型啟動子進行兩階段發酵生產之外，及時將目標產物轉運出細胞也是重要研究策略。研究表明，通過表達大腸桿菌來源的轉運蛋白AcrB和Grosmania clavigera的ATP結合轉運超家族ABC-G1蛋白，能夠促進甜沒藥烯外排［92］。

實驗室適應進化結合反向代謝工程是一種提高微生物特定表型的有效策略［93］。在釀酒酵母中，通過實驗室適應進化，提高了工程菌對中鏈脂肪酸的耐受性從而加強了生產能力［94］，證實連續細胞培養傳代能夠提高細胞對某一特定化合物的耐受能力。特別是，近年來組學技術蓬勃發展，將馴化后得到的菌株借助基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等多組學聯用分析，將強化非傳統酵母細胞工廠耐受性，并提供新的靶點和理論認識。

4.4 復雜產物譜拓展

目前，非常規酵母合成天然產物主要集中在萜類化合物和黃酮類化合物（表1和表3），但隨著技術的不斷完善，更加復雜的天然產物合成將是未來重要的研究方向。其中，生物堿就是復雜天然產物的代表，它是一類具有復雜環結構的含氮呈堿性的有機化合物（除氨基酸、維生素等化合物以外）。它們往往具有非常強的生物活性，比如可卡因具有麻醉作用、長春堿和長春新堿用于治療急性淋巴癌。由于生物堿的結構多樣、種類眾多、合成途徑復雜，目前在非常規酵母中暫時未見報道。圖5對近年來受到廣泛關注的并且在釀酒酵母中實現從頭合成的單萜生物堿、芐基喹啉生物堿和脫品生物堿的生物合成途徑進行了歸納總結，可以看出，生物堿的生物合成和萜類、黃酮類化合物具有較多相同前體物質，但需要更多的P450氧化還原酶等修飾酶。鑒于非常規酵母在合成復雜萜類及黃酮類化合物上表現優異，相信隨著基因操作平臺工具的完善，非常規酵母在合成生物堿等復雜天然產物上將會大放異彩。

圖5 常見生物堿合成途徑Fig. 5 Common alkaloids biosynthetic pathways

總之，雖然模式生物釀酒酵母和大腸桿菌在高附加值天然產物的合成上取得良好進展，但是非常規酵母由于其獨特優勢，有望成為天然產物合成的潛在底盤細胞。在目前基因操作嚴重受限條件下，非常規酵母細胞工廠在萜類化合物和黃酮類化合物的合成上展現較大的應用潛力。相信隨著基因編輯工具的發展、基因元件的開發以及發酵過程優化，非常規酵母將在天然產物生物合成上扮演越來越重要的角色，為其大規模工業化生產提供堅實技術支撐。