膠孢炭疽菌細胞骨架熒光標記菌株的構建

劉娜 劉世科 王倩男

（海南大學熱帶作物學院 海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228）

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）寄主廣泛，其多個不同的生理小種能夠侵染諸如橡膠樹、香蕉、火龍果、香瓜、西瓜等多種經濟作物，是造成農業減產的主要病害之一。深入研究膠孢炭疽菌的致病力機制，有助于新型防控措施的開發。

細胞極性的確立和維持在真核生物的形態發生過程中起著重要的作用。絲狀真菌的分生孢子萌發后，菌絲呈現出明顯的極性生長現象［1-3］。在這個極性生長過程中，細胞壁及細胞膜前體物質、細胞器以及囊泡等不斷運輸匯集到菌絲頂端的特殊結構（spitzenk?rper，Spk）［4］。Spk由密集的囊泡、細胞骨架、核糖體及其他多種物質組成［5-6］；與此同時，Spk介導的菌絲頂端胞外物質分泌也與真菌的生長發育及致病力密切相關［7-8］。雖然目前關于Spk的形成及其機制還尚不清楚，但是普遍認為細胞骨架在其中起著重要作用。細胞骨架廣泛存在于真核生物的細胞質及細胞核中。細胞骨架在細胞分裂、細胞生長等多項生理活動中具有重要的功能。細胞質骨架主要包括微絲、微管和中間纖維，其中關于微絲和微管的研究較多。微絲（microfilament）是由單體肌動蛋白（actin）呈螺旋狀排列組裝而成；微管（microtubule）是由α-微管蛋白（tubulin）和β-微管蛋白通過非共價鍵連接組成的中空管狀結構。在細胞內，微絲和微管均處于聚合和解聚的高度動態循環中，而這一動態過程分別受一系列微絲結合蛋白（actin binding protein，ABP）和微管結合蛋白（microtubule associated protein，MAP）的精密調 控［9-10］。至今為止，尚未有關膠孢炭疽菌細胞骨架研究的相關報道。

Lifeact是來自出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）ABP140（actin binding protein 140）一段17個氨基酸的多肽，其序列被廣泛用作真核生物細胞內微絲骨架標記探針［11-12］，已有研究結果表明Lifeact能很好的標記出稻瘟菌、灰霉菌等真菌細胞中的微絲骨架結構［13-14］。而在微管研究中發現，鼠微管相關蛋白MAP4（microtubule associated protein 4）的微管結合結構域MBD（microtubule binding domain）能很好的標記出植物細胞內微管的結構［12，15］。因此，本研究構建了增強型綠色熒光蛋白EGFP（enhanced green fluorescent protein）與Lifeact及MBD的融合表達載體，將其轉化膠孢炭疽菌并獲得了相應的重組菌株。與此同時，還在膠孢炭疽菌β-微管蛋白（β-tubulin）編碼基因（CgTUB1）后面原位敲入了EGFP的編碼序列，構建了CgTUB1-EGFP標記菌株。顯微觀察及生理表型分析結果表明，所構建的Lifeact-EGFP及CgTUB1-EGFP的重組菌株的微絲及微管骨架標記清晰，為進一步研究膠孢炭疽菌細胞骨架的動態變化及骨架結合蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 橡膠樹膠孢炭疽菌野生型菌株由本實驗室分離保存，并在前期工作中完成該菌株的基因組測序工作。

1.1.2 實驗試劑 實驗所用基因表達載體pPgTH由本實驗室改造，以pMD19-T為骨架，在Pst I和Xba I位點處連入構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子PgpdA，在Sac I和EcoR I處連入構巢曲霉色氨酸合成基因trpC的終止子（TtrpC）及潮霉素磷酸轉移酶抗性基因（HPT）。PCR引物合成及DNA測序由華大基因及擎科生物公司完成。DNA聚合酶、DNA Marker及大腸桿菌感受態均購自北京全式金公司，限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根公司。羧芐青霉素、卡那霉素購自索萊寶公司，潮霉素購自Roche公司，其它化學試劑采用國產分析純。膠孢炭疽菌的培養使用土豆浸膏培養基 （PDA，PDB）及基本培養基（minimal medium）。

1.2 方法

1.2.1 微絲骨架標記載體的構建 采用隨機重組原理敲入標記基因，具體策略如圖1-A所示，將Lifeact與綠色熒光蛋白EGFP的融合編碼序列Lifeact-EGFP連入基因表達載體pPgTH的Xba I和Sac I位點，構建微絲標記載體。

1.2.2 微管骨架標記載體的構建 分別采用隨機重組原理及同源重組原理等兩種策略構建兩種微管骨架標記載體［16］。（1）將鼠MAP4的微管結合結構域MBD與綠色熒光蛋白EGFP的融合編碼序列MBDEGFP連入載體pPgTH的Xba I和SacI位點，構建微管標記載體（圖1-B）。（2）將膠孢炭疽菌β1 tubulin DNA序列CgTUB1的3'端序列（去除終止密碼子，853 bp）連入載體pPgTH的Xba I和Kpn I位點，將EGFP編碼序列連入Kpn I和Sac I位點，再使用引物CgTub-SF/hph-splR將這兩個片段與潮霉素抗性基因編碼序列（HPT）的5'端序列PCR擴增備 用，所得產物為左側敲除片段；之后將HPT的3'端序列與CgTUB1的下游序列（flanking region，804 bp）進行融合PCR擴增備用，所得產物為右側敲除片段；最后將兩個敲除片段共同轉化野生型菌株，將CgTUB1 DNA的3'端序列作為上游同源臂、CgTUB1的下游序列作為下游同源臂，利用同源重組原理將EGFP編碼序列原位敲入CgTUB1的下游，構建敲入重組菌株（圖1-C）。

圖1 細胞骨架熒光標記載體原理圖Fig. 1 Diagram of fluorescent labeled cytoskeleton vectors

1.2.3 原生質體轉化 橡膠樹膠孢炭疽菌原生質體的制備及轉化參照文獻［3］所述方法進行。在轉化前，將Lifeact-EGFP、MBD-EGFP及CgTUB1-EGFP標記載體用Pst I進行酶切線性化處理。

1.2.4 重組菌株的鑒定 本實驗中采用潮霉素（300 μg/mL）篩選轉化子。待轉化、再生培養后，將陽性轉化子轉接到PDA培養基進行擴大培養，并提取其基因組DNA進行PCR鑒定。對于轉化過Lifeact-EGFP或MBD-EGFP的轉化子，以其基因組為模板，分別擴增其基因組中是否已經轉入目標序列。對于CgTUB1-EGFP轉化子，為了檢測敲入重組菌株中EGFP編碼序列是否重組到CgTUB1基因后面，本實驗中采用兩輪PCR檢測方法鑒定轉化子，在重組片段中的上游同源臂的外側及EGFP序列中設計一對檢測引物CgTub-JCF/EGFP-R；同理，再在下游同源臂的外側及抗性基因HPT序列中設計一對檢測引物HPT-JCF/CgTub-JC3R；通過PCR擴增檢測重組片段是否正確整合到目標基因的位點（表1）。在獲得以上所述3種陽性重組菌株后，通過單孢分離對篩選到的重組菌株進行分離純化。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察重組菌株中細胞骨架 將獲得的純合體重組菌株接種于PDB培養基中，28℃震蕩培養2 d后，過濾收集孢子，用ddH2O洗滌2遍后重懸，再于激光共聚焦顯微鏡下觀察孢子內微絲或微管骨架的分布情況。與此同時，將上述孢子接種于新鮮的PDB培養基中，震蕩培養24 h后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察菌絲內微絲或微管骨架的分布情況。所有熒光圖片均采自Leica SP8激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。EGFP由Argon 激光器488 nm通道激發，檢測的發射波長范圍是505-540nm。靜態層掃圖片的步距為0.5 μm。所有圖片均通過Image J 軟件進行后期疊加及處理。

1.2.6 生長速率及產孢量檢測 參照文獻［3］所述方法進行。

1.2.7 致病力分析 參照文獻［3］所述方法進行。每個處理共包含30片葉片，分為3組。本實驗共重復2次。

2 結果

2.1 重組菌株的鑒定

膠孢炭疽菌原生質體轉化后分別獲得了多個具有潮霉素抗性的陽性轉化子。接著將轉化子轉接到PDA平板進行培養，提取其DNA，并利用PCR檢測各轉化子。實驗中共獲得了多個Lifeact-EGFP及MBD-EGFP表達載體轉化子；分別隨機挑取4個轉化子，并用PCR擴增檢測其基因組中是否已轉入Lifeact-EGFP或MBD-EGFP片段。結果這兩組轉化子均能檢測到目標片段（圖2-A，B），表明標記重組菌株構建成功，分別將這兩組重組菌株命名為PgpdA∷Lifeact-EGFP和PgpdA∷MBD-EGFP。與此同時，挑取了10個CgTUB1-EGFP基因敲入重組轉化子，并對轉化子進行兩輪PCR檢測。結果有3個轉化子能夠同時成功擴增出1 722 bp、1 648 bp大小的目標條帶（圖2-C，D），且PCR產物測序結果也與預期結果一致，表明這3個轉化子均已在CgTUB1的DNA序列后面敲入了EGFP編碼序列，因此將這3個轉化子命名為CgTUB1-EGFP。之后通過單孢分離，分別獲得了PgpdA∷Lifeact-EGFP、PgpdA∷MBD-EGFP和CgTUB1-EGFP的純合體重組菌株。

圖2 細胞骨架熒光標記重組菌株的PCR鑒定Fig. 2 PCR diagnosis of cytoskeleton labeling recombinant strains

2.2 重組菌株細胞骨架觀察

將上述獲得的PgpdA∷Lifeact-EGFP純合體重組菌株制片后置于共聚焦顯微鏡下觀察其微絲骨架。結果發現在其孢子及菌絲細胞內均能檢測到明顯的熒光，并且與只表達EGFP的對照菌株相比，重組菌株孢子內微絲主要以點狀信號分布，也有少量絲狀結構存在（圖3）。在菌絲中，可在其頂端觀察到明顯的微絲聚集現象，呈明顯的極性分部；此外在細胞中間部位，也能觀察到絲狀結構（圖4）。以上結果表明Lifeact-EGFP能夠較好的標記膠孢炭疽菌的微絲骨架。隨后，選擇了其中一株熒光強度較高的重組菌株進行后續研究。

將上述獲得的PgpdA∷MBD-EGFP及CgTUB1-EGFP純合體重組菌株制片后置于共聚焦顯微鏡下觀察其微管骨架。結果發現PgpdA∷MBD-EGFP菌株細胞內熒光強度極低，難以觀測到其孢子及菌絲內部的微管骨架結構（結果未展示）；而CgTUB1-EGFP標記重組菌株的孢子及菌絲細胞內均能檢測到明顯的熒光。如圖3所示，與對照菌株相比，標記菌株孢子內的微管主要呈點狀和絲狀結構。在菌絲內部微管也呈現出較明顯的極性分布現象，此外，微管主要以點狀和絲狀分布于菌絲中間（圖4）。以上結果表明CgTUB1-EGFP能較好的標記微管骨架。隨后，選擇了其中一株熒光強度較高的CgTUB1-EGFP重組菌株進行后續研究。

圖3 熒光標記重組菌株孢子中的細胞骨架結構Fig. 3 Cytoskeleton structure in conidiophores of fluorescent labeled recombinant strains

圖4 熒光標記重組菌株菌絲中的細胞骨架結構Fig. 4 Cytoskeleton structure in the hypha of fluorescent labeled recombinant strains

2.3 重組菌株生長速率及產孢量檢測

在PDA培養基中培養時，PgpdA∷Lifeact-EGFP、CgTUB1-EGFP重組菌株與野生型菌株相比，其菌落生長速率及菌落形態都沒有顯著差別（圖5-A），在培養4 d后，菌落直徑均約為6 cm。與此同時，在液體PDB培養基中培養3 d后，重組菌株的產孢量與野生型相比也沒有顯著變化，孢子產量都約為35×105個/mL（圖5-B）。

圖5 野生型菌株與重組菌株菌落直徑及產孢量Fig. 5 Clony diameters and conidiations of WT and mutant strains

2.4 重組菌株致病力分析

將PgpdA∷Lifeact-EGFP、CgTUB1-EGFP重組菌 株與野生型菌株同時接種橡膠樹葉片。在接種后，重組菌株與野生型菌株均能侵染橡膠樹葉片并造成病斑；與此同時，在接種2 d及3 d后，重組菌株與野生型菌株形成的病斑直徑均約為10 mm及20 mm（圖6）。表明重組菌株與野生型菌株致病力沒有明顯差異。

圖6 接種野生型菌株與重組菌株后橡膠樹葉片的發病情況及病斑直徑Fig. 6 Virulence assay on rubber tree leaves and lesion diameter after inoculation with WT and recombinant strains

3 討論

細胞骨架廣泛存在于真核生物細胞中，并在其形態建成、物質運輸與極性生長等方面有著重要的功能。絲狀真菌的生長和發育主要依賴菌絲尖端的極性生長，而這種極性生長受到細胞內骨架的嚴格調控［17-18］。近年來，越來越多的研究揭示了細胞骨架的結構及其動態變化在絲狀真菌形態發生與致病過程中的作用［19-21］。因此，要研究膠孢炭疽菌中細胞骨架結構及其動態變化及相關蛋白功能，對胞內細胞骨架進行熒光標記和活體細胞觀察是必要的。由于actin-GFP（green fluorescent protein）難以加入到聚合的微絲中，若直接對actin進行熒光標記還會導致單體肌動蛋白被標記且呈現較強熒光背景［22］。此外，actin-GFP的表達嚴重影響了盤基網柄菌細胞（Dictyostelium）的胞質分裂等生理生化活動［22］。目前對于微絲骨架的活體細胞成像來說，主要通過微絲結合蛋白來標記F-actin，如擬南芥AtFIM1的微絲結合結構域ABD2［23］，以及酵母ABP140的一段僅17個氨基酸的保守結構域Lifeact［24-29］。Delgado-Alvarez的相關研究表明，通過對粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）多個微絲結合蛋白及其結構域與綠色熒光蛋白GFP進行融合表達，構建了多種熒光標記菌株：Fimbrin-GFP，ARP3-GFP，tropomyosin-GFP，Lifeact-GFP；結果發現不同的熒光標記菌株能標記出菌絲內不同的微絲骨架結構，但Lifeact-GFP能較好的標記出菌絲不同部位的多種結構［30］。此外，Lifeact也被廣泛用于其他真菌胞內微絲骨架的標記［13，31-33］。在此基礎上，本研究構建了PgpdA∷lifeact-EGFP表達載體，通過膠孢炭疽菌原生質體轉化成功構建了重組菌株，并對微絲骨架的三維立體結構進行了活體觀察。結果表明，在膠孢炭疽菌中微絲主要以點狀信號分布于孢子中，以點狀和絲狀結構分布于菌絲中，且呈現出明顯的極性分布現象，這一結果也與其它真菌中觀察到的結果相類似［13，30］。在絲狀真菌中，點狀微絲結構是細胞內吞作用的標志［34］。稻瘟菌中菌絲頂端點狀微絲結構的減少會導致胞吞作用明顯延遲，效應因子分泌受阻，致病力受到嚴重的影響［35］。

而對于微管骨架，常用小鼠MAP4的MBD與熒光蛋白融合進行標記［15，36］，或直接用tubulin與熒光蛋白融合來標記動植物細胞中的微管骨架［37］；但是在不同生物的不同組織中，兩種標記方法的效果不盡相同。在構巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，利用GFP-TUA（α-tubulin）菌株來觀察菌絲中的微管骨架結構［38-39］。在粗糙脈孢霉中，β-tubulin-GFP被用來標記胞內的微管骨架［40］。在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中，多用FgTub1-GFP及FgTub2-GFP來標記胞內的微管骨架［21，41-42］。在本研究中分別使用了兩種方法對膠孢炭疽菌的微管結構進行標記：構建了PgpdA∷MBD-EGFP-TtrpC表達載體與CgTUB1基因位點后EGFP敲入載體，并通過原生質體轉化成功獲得重組菌株。結果表明，MBD-EGFP標記重組菌株中熒光強度較低，而CgTUB1-EGFP標記重組菌株熒光強度較高；與此同時，在CgTUB1-EGFP重組菌株孢子和菌絲中都可觀察到明顯的點狀和絲狀信號，且在菌絲尖端的微管骨架也呈現出一定的極性分布現象。

為了檢測兩種骨架標記重組菌株是否會對膠孢炭疽菌正常的生理活動產生影響，本研究分別選擇了兩株熒光強度較高的PgpdA∷lifeact-EGFP和CgTUB1-EGFP重組菌株，對其生理表型進行了分析。結果發現這兩種細胞骨架的熒光標記并不影響膠孢炭疽菌的生長、產孢及致病力，表明本研究所構建的重組菌株能夠用于后續分析。

絲狀真菌細胞頂端極性的建立、維持都需要細胞骨架的參與，其結構的動態變化在細胞生長、胞內物質運輸以及外泌過程中扮演著至關重要的角色，因而在其致病過程中也發揮著重要的作用［43］。細胞骨架結構由肌動蛋白、微管蛋白及很多相關蛋白（ABPs，MAPs）共同調控。且微管蛋白還是很多真菌殺菌劑的作用靶點［42］。鑒于此，對于膠孢炭疽菌中微絲微管骨架的熒光標記將有利于推動對其菌絲生長及致病過程中細胞內骨架分布、動態變化及其相關蛋白功能，以及對殺菌劑作用機理的研究。

4 結論

本研究構建了膠孢炭疽菌微絲及微管骨架的標記重組菌株，為今后深入研究膠孢炭疽菌微絲和微管骨架的結構、動態變化、以及細胞骨架相關蛋白的功能奠定了良好的基礎。