以次生代謝物產量為目標的西蘭花毛狀根培養技術體系優化

張秀民 馬紹英 楊潔 包金玉 張曉玲 田鵬 路亞琦 李勝

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學基礎實驗教學中心，蘭州 730070）

西 蘭 花（Brassica oleracea L var. italica Planch）屬十字花科蕓薹屬甘藍種，以無數花梗和花蕾組成的花球為主［1］，因含有硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLS）、類胡蘿卜素和酚類等豐富的生物活性化合物而備受關注［2］。蘿卜硫苷（glucoraphanin，GRA）是屬于脂肪族GLS的一種［3］，GRA其本身并不具有生物活性，但當植物細胞受到損傷或破壞時，與存在于特殊的成纖維細胞-芥子細胞中的黑芥子酶（myrosinase，MYR）發生酶解［4］，進而形成多種化合物，如異硫氰酸鹽、腈和硫氰酸鹽等物質［5］。蘿卜硫素（sulforaphane，SF）是異硫氰酸鹽的一種，是迄今為止在蔬菜中發現具有強抗癌、防癌作用的次生代謝產物［6-7］。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是一種帶有特殊香氣的物質，分離自茉莉花精油［8］。作為誘導子，MeJA不僅可以在細胞膜間內源信號轉導中起作用，而且能夠提高植物次生代謝產物含量［9］。已有研究表明，外源添加MeJA可以增加西蘭花和其他蕓苔屬作物GLS含量，增強癌癥化學預防和抗氧化活性［10］。目前，SF及GRA主要從西蘭花種子和幼苗中獲得，成本高且產量低。前期本課題組已成功建立西蘭花毛狀根培養體系，研究發現西蘭花毛狀根中SF含量顯著高于西蘭花無菌苗，分別是西蘭花無菌苗葉片、幼根的13、31.28倍［11］。然而，由植物細胞生物合成的具有高效利用價值的大多數代謝物都儲存在細胞內，從復雜的植物細胞或組織中提取純化代謝物質成本高昂，嚴重障礙大規模生產。主動性釋放可以在植株整個生命周期內產生高產量的植物次生代謝物質，可解決由次生代謝物在細胞或組織中大量積累帶來的反饋抑制，并促進其下游產物的提純；與植物組織的提取溶劑相比，自主性釋放的分泌物是相對簡單的混合物，這使得化學物質的分離變得更容易［12］。本實驗室前期研究發現，西蘭花毛狀根經MeJA處理使得毛狀根中SF大量釋放到MS液體培養基中，且液體培養基中SF的釋放量是毛狀根中SF含量的12.3倍［13］。已有研究表明，MeJA處理水飛薊細胞懸浮液可提高水飛薊素的含量并使其釋放到液體培養基中［14］，María Perassolo等［15］研究表明，100 μmol/L的MeJA能夠提高茜草毛狀根中的蒽醌類化合物含量并使其釋放至液體培養基中，但MeJA誘導西蘭花毛狀根中GRA和SF釋放研究未見報道。

本研究通過外源添加MeJA誘導西蘭花毛狀根，在單因素實驗基礎上，以接種量、pH、培養溫度為自變量，以西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF總產量為響應值，利用Design-expert8.0.6軟件設計響應面實驗，為揭示西蘭花毛狀根次生代謝物GRA和SF釋放機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以甘肅農業大學生命科學技術學院植物組織培養實驗室“中青9號”西蘭花無菌苗葉片經發根農桿菌“ATCC15834”誘導獲得的毛狀根及其液體培養基為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 MeJA處理西蘭花毛狀根 將西蘭花毛狀根統一轉接于新配置MS液體培養基，西蘭花毛狀根在靜止期（18-21 d）產生SF并少量釋放，21 d為最佳收獲時間，且在添加10 mmol/L MeJA時顯著增加培養基中SF含量，因此選擇西蘭花毛狀根生長至第18 天添加MeJA［13］。在各個處理條件下，采集MeJA處理的樣本，用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸取多余水分，于-20℃冰箱保存，作為后續GRA和SF活性成分提取的實驗材料。設置3次重復試驗。

1.2.2 單因素實驗 單因素實驗設計見表1。

表1 單因素實驗設計Table 1 Single factor experimental design

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法中的Box-Behnken Design建立數學模型，選取培養溫度（℃）、毛狀根接種量（g）以及pH為自變量，以西蘭花毛狀根中GRA及SF總產量為指標進行優化實驗設計，設計三因素三水平響應面實驗（表2）。

表2 Box-behnken試驗因素水平表Table 2 Box-behnken test factor levels

1.2.4 西蘭花毛狀根培養體系GRA和SF的提取與檢測 西蘭花毛狀根培養體系GRA的提取及檢測參考包金玉［13］的方法，SF的提取及檢測參考包金玉［13］的方法。

1.2.5 黑芥子酶活性的測定 參照Burow的方法略作改進［16］，取0.5 g各處理的西蘭花毛狀根，用3 mL 0.1mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液在冰浴下研磨，超聲波浸提20 min，4℃下10 000×g離心15 min，上清液即為粗酶液。粗酶液中蛋白質含量采用考馬斯亮藍蛋白質試劑盒測定（中國南京建成生物有限公司）。取200 μL粗 酶 液 與200 μL 2 mmol/L sinigrin（Sigma，CAS：3952-98-5）混合，于37℃水浴反應15 min，然后轉移至沸水浴中5 min停止反應，用葡萄糖試劑盒（中國南京建成生物有限公司）測定葡萄糖含量。以每分鐘被MYR轉化生成1 nmol葡萄糖為1個酶活力單位（U/mg protein）。

2 結果

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 接種量對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響 接種量影響西蘭花毛狀根的增殖，而增殖又會影響GRA和SF的合成。隨著接種量增加，毛狀根中GRA產量、培養基中SF產量和毛狀根中SF產量均呈現先升高后降低的趨勢；MYR的活性也隨接種量的增大而升高（圖1）。毛狀根接種量為0.15 g時，毛狀根中GRA產量顯著高于其他處理，達1 105.13 μg/flask，是培養基中GRA產量的34.07倍；此時培養基中SF產量顯著高于其他處理，可達840.57 μg/flask，是毛狀根中SF產量的29.95倍。培養基中SF的產量遠高于毛狀根中，而GRA在毛狀根中的產量比在培養基中的高。因此，可以初步得出，當接種量為0.15 g時，毛狀根中的GRA在MYR的作用下大部分轉化為SF，使其釋放到培養基中，從而使得培養基中的GRA釋放量減少，此時毛狀根中77.31%的SF釋放到培養基中。因此控制毛狀根的接種量為0.15 g時，有助于SF向培養基中釋放。

圖1 接種量對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 1 Effects of inoculation amount on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.2 轉速對西蘭花毛狀根培養體系中SF和GRA釋放的影響 轉速在液體懸浮系統中既影響著培養物的物理狀態也影響著生理狀態。在西蘭花毛狀根細胞培養懸浮體系中，不同的剪切力會影響西蘭花毛狀根的增殖，進而影響次生代謝物的合成。如圖2所示，轉速為110 r/min時，毛狀根中GRA產量顯著高于其他處理，達879.62 μg/flask；培養基中GRA和SF產量均顯著高于其他處理，分別為37.07 μg/flask和958.54 μg/flask，此時培養基中SF產量是毛狀根中SF產量的53.69倍。伴隨轉速增大，毛狀根受到的剪切力也同步增大，使得GRA和MYR發生反應，產生大量SF，導致SF和GRA向培養基中釋放，同時，培養基中的溶氧量也影響毛狀根的生長。因此可以初步得出，毛狀根中GRA和SF的釋放和剪切力相關，并且轉速為110 r/min時，GRA和SF的釋放量最大。

圖2 轉速對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 2 Effects of rotating speed on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.3 pH對西蘭花毛狀根培養體系中SF和GRA釋放的影響 pH值的變化主要影響到細胞質膜電位，從而影響細胞質膜透性，使細胞內外物質的交流發生變化，特別是在pH 4-6之間時更加明顯。如圖3所示，隨著pH的增加，西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF產量整體呈現先升高后降低的趨勢，且隨著pH的增大，SF的總產量逐漸減小。pH為6.0時，此時毛狀根中GRA產量為830.50 μg/flask，是培養基中GRA的23.43倍；pH為5.5時，培養基中SF產量顯著高于其他處理，達到930.51 μg/flask，是毛狀根中SF的13.31倍。由于酸堿度影響毛狀根的生長發育以及次生代謝物的合成，此時毛狀根中的GRA大部分經由MYR水解轉變為SF并釋放到培養基中，少部分繼續留在毛狀根中。因此可以初步得出，酸堿度可以在一定程度上影響GRA和SF向培養基中的釋放，且當pH為5.5時，SF向培養基中釋放量達到最大。

圖3 pH對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 3 Effects of pH on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.4 培養溫度對西蘭花毛狀根培養體系中SF和GRA釋放的影響 如圖4所示，隨著培養溫度的升高，西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF的產量隨著溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢，而MYR的活性隨著溫度的升高隨之增大。當溫度為25℃時，毛狀根中GRA的產量顯著高于其他處理，達1 032.78 μg/flask，此時培養基中SF產量也達到最高為752.06 μg/flask，是毛狀根中SF產量的6.7倍。培養溫度過低不利于毛狀根的生長增殖，進而影響次生代謝物的生物合成，由此可得出，毛狀根在不同生長溫度下其增殖狀況及次生代謝物的合成也隨之不同。因此控制培養溫度為25℃時，有利于毛狀根中GRA的合成積累，有助于毛狀根中SF向培養基中釋放。

圖4 培養溫度對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 4 Effects of culture temperature on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.5 培養基體積對西蘭花毛狀根培養體系中SF和GRA釋放的影響 根據本實驗室前期研究，培養基體積會影響GRA和SF的合成，可能是培養基中營養需求差異所導致的。如圖5所示，西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF產量由于培養基的體積增大整體呈現先升高后降低的趨勢。培養基體積為100 mL時，毛狀根中及培養基中GRA產量均顯著高于其他處理，分別為713.33 μg/flask和158.68 μg/flask。培養基體積為110 mL時，MYR的活性達到最大，MYR與GRA水解生成SF，使SF釋放至培養基中，此時培養基中SF的產量也顯著高于其他處理，達911.95 μg/flask。培養基體積增大，錐形瓶中的含氧量減少，影響毛狀根生長發育。因此可以初步得出，由于培養基體積增加導致培養基中含氧量減少，毛狀根受到低氧脅迫導致SF含量增大并向培養基中釋放。因此控制培養基體積為100 mL時，有助于毛狀根中GRA和SF的生物合成，而培養基體積為110 mL時，有助于SF向培養基中釋放。

圖5 培養基體積對西蘭花毛狀根培養體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 5 Effects of medium volume on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.2 響應面實驗優化結果分析

2.2.1 響應面實驗分析 由以上單因素實驗結果可得出，各個因素對西蘭花毛狀根中GRA總產量的影響順序為：培養溫度＞接種量＞pH＞培養基體積＞轉速；對西蘭花毛狀根中SF總產量的影響順序為：pH＞接種量＞培養溫度＞培養基體積＞轉速，綜合單因素實驗結果，選取對毛狀根中GRA和SF總產量有顯著影響的培養溫度（℃）、pH以及毛狀根接種量（g）3個因素為自變量，采用響應面分析方法進行試驗設計，以-1、0、1分別代表變量的水平，響應面分析方案及實驗結果見表3。

表3 響應面設計與實驗結果Table 3 Response surface design and experimental results

2.2.2 二次回歸方程模擬及方差分析 用DX8.0.6響應面軟件對表2中的實驗結果進行分析，得到二次回歸模型方程：Y=+2.43+0.030A+0.15B+0.059C-0.13AB+0.075AC+0.12BC-0.48A2-0.37B2-0.36C2

對回歸方程進行方差分析，由表4可知，模型顯著性檢驗P＜0.05，表明模型顯著，具有統計學意義。失擬項P值為0.3701＞0.05，失擬不顯著。模型的校正決定系數R2Adj為0.8629，能解釋約86.29%的響應值變化，決定系數R2為0.9091，擬合程度良好，實驗誤差小。從單因素水平觀察，其影響順序為：接種量＞pH＞培養溫度。在有交互作用存在的條件下，對西蘭花毛狀根GRA和SF總產量的影響順序為AB＞BC＞AC。利用該回歸方程確定最佳培養條件：毛狀根接種量為0.15g，培養溫度為25.44℃，pH為5.56，在此條件下進行驗證實驗，重復3次，西蘭花毛狀根中GRA和SF總產量為2.08 mg/flask，回歸模型預測理論總產量為2.44 mg/flask，驗證值低于預測值，其相對誤差為1.8%，因此該回歸方程具有可行性。

2.2.3 各元素交互作用 回歸方程顯示，各因素之間存在交互作用，圖6-8響應面圖反映了各因素在西蘭花毛狀根培養過程中對響應值的影響，投影為等高線圖，響應面的坡度陡峭程度直觀反映了各因素對響應值的影響。從表4中可得，二次項A2、B2和C2對總產量均具顯著性影響（P＜0.01）。

圖6 Y=f（A，B）的響應面Fig. 6 Responsive surface plot of Y=f（A，B）

表4 響應面方差分析Table 4 Analysis of variance response surface

3 討論

MeJA是誘導子的一種，會刺激植物并影響植物體內次生代謝物的合成與積累［17］。王瑜等［18］研究發現MeJA處理王不留行毛狀根能顯著促進黃酮苷產生。孫際薇［19］研究發現MeJA能有效刺激曼陀羅毛狀根中東茛菪堿、茛菪堿成分迅速積累并向培養基中釋放。Cacho等［20］研究發現在水飛薊懸浮培養體系中添加MeJA后水飛薊素在液體培養基中的量提高了2倍。在本研究中，通過外源添加MeJA，不僅顯著促進了西蘭花毛狀根中GRA和SF的積累，而且使GRA和SF大量釋放至液體培養基中，為GRA和SF的提取提供便利，極大降低了整個提取過程的成本。在植物細胞受到損傷或破壞時，存在于液泡中的GRA與存在于芥子素細胞的MYR發生酶解反應，得到酶解產物SF，在毛狀根中GRA的含量遠遠高于SF，液體培養基中SF的含量遠遠高于GRA，說明SF可能是一個積累的過程，SF對GRA合成的反饋抑制效應較GRA本身強，加速了SF的釋放，從而促進毛狀根中GRA的大量合成［21］。

接種量影響離體植物器官的生長發育，接種量過多或過少都不利于毛狀根的生長［22］。本研究結果表明，隨著接種量的增大，毛狀根SF釋放量呈先增后降的趨勢，推斷這是由于SF對GRA的合成反饋抑制效應比GRA強，加速了SF的釋放。此外，毛狀根群體效應也是影響SF和GRA釋放的因素，伴隨接種量的增大，群體效應導致西蘭花毛狀根中GRA和SF釋放量增大，但接種量過大，會導致培養體系中營養物質缺乏，影響毛狀根的正常生長［23］。

圖7 Y=f（A，C）的響應面Fig. 7 Responsive surface plot of Y=f（A，C）

圖8 Y=f（B，C）的響應面Fig. 8 Responsive surface plot of Y=f（B，C）

培養基的體積決定培養基中營養成分以及容器中的含氧量。韓昱姝［24］研究擴大培養基體積對金鐵鎖毛狀根次生代謝物的影響，發現2 L生物反應器相較于1 L三角瓶生物量和皂苷含量增加卻不多的原因是通氣量不足等因素造成。袁金玲等［25］在進行孝順竹愈傷組織懸浮培養條件優化時得出在200 mL三角瓶中培養基體積為50 mL時，懸浮細胞有較好的增殖能力以及優良的增殖狀態。本研究結果表明，當培養基體積為100 mL時，SF向培養基中的釋放量達到最大；當培養基體積為110 mL時，GRA向培養基中釋放量達到最大，這可能是由于培養基體積增加導致培養基中含氧量減少，使得毛狀根中次生代謝物釋放到培養基中，當培養基體積過少時，培養基中溶氧量增加，但不能為毛狀根提供充足的營養物質。Cai等［12］的研究結果也表明葡萄懸浮培養細胞培養基體積增大，釋放到培養基中白藜蘆醇的量增大。

剪切力也是液體培養中一個不可忽視的影響因素。毛狀根懸浮培養是在恒溫振蕩器中進行的，當毛狀根與玻璃器皿瓶壁長時間摩擦導致細胞破碎后，GRA與MYR在液體環境下接觸發生水解反應［26］。隨著轉速增加，剪切力增強，毛狀根受損增大，使得SF的釋放量提高。本研究結果表明，當轉速為110 r/min時，SF和GRA向培養基中的釋放量達到最大。

伴隨毛狀根的生長，培養基中的微環境發生了變化，隨之pH也發生變化，研究結果表明毛狀根在偏酸性環境中生長更好，這與趙生琴［27］研究結果相似。葉國洪等［28］的研究表明，煙草細胞在培養基原始pH 4.0-8.0下均能生長，但在pH 6.0時細胞生長最好，CoQ10含量最高。GRA酶解后形成的糖苷配基中間體在pH 5-8范圍內可重排得到SF等異硫氰酸鹽［29］。本研究結果表明，當pH為5.5時，SF和GRA向培養基中釋放量達到最大。

溫度的變化不僅對植物光合生態生理的進行及有機化合物的生物合成有影響，還對植物內部因素（酶活性大小、呼吸作用）有較大的影響［30］。毛狀根最適生長溫度為20℃-28℃，李翠芳等［31］研究了新疆紫草毛狀根在26℃條件下生長狀況較好，低于或高于26℃，紫草毛狀根的生長均受到不同程度的抑制；李春玲［32］研究了溫度對水飛薊毛狀根增值的影響，當溫度為26℃時，毛狀根生長旺盛，其增值倍數相較于對照最高達31.67倍。而在本研究中，當培養溫度為25℃時，GRA和SF總產量均達到最大且釋放到培養基中的量也達到最大。

4 結論

在單因素實驗基礎上，接種量、pH以及培養溫度對GRA和SF總產量影響顯著，以西蘭花毛狀根培養體系GRA和SF總產量為響應值，利用Designexpert8.0.6得出最佳培養條件：毛狀根接種量為0.15 g，培養溫度為25.44℃，pH為5.56，在此條件驗證得出：西蘭花毛狀根中GRA和SF總產量為2.08 mg/flask，與回歸模型預測理論總產量2.44 mg/flask接近，其相對誤差為1.8%。