基于質譜的分子網絡分析化學調控對土曲霉C23-3次生代謝產物及生物活性的影響

馬小翔 劉亞月，，3 聶影影 黎燕媚 王遠 薛欣怡 洪鵬志，，3 張翼，，3

（1. 廣東海洋大學食品科技學院 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 廣東省海洋生物制品工程實驗室 廣東省海洋食品工程技術研究中心 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室 湛江市腦健康海洋藥物與營養品重點實驗室 廣東海洋大學海洋藥物研究所，湛江 524088； 2. 廣東海洋大學深圳研究院海洋醫藥研發中心，深圳 518120；3. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心 大連工業大學， 大連 116034）

海洋約占地球總面積的71%，蘊含著種類多樣、活性豐富的微生物資源［1］。海洋生物尤其是海洋微生物在海洋高鹽、高壓、低氧、寡營養的特殊環境下，產生獨特的新陳代謝機制，進而能生成結構新穎、活性豐富的次級代謝產物，為藥物先導化合物提供豐富來源［2-3］。海洋真菌因遺傳背景復雜、代謝產物種類豐富、產量高，逐漸成為海洋微生物新天然產物的主要來源，在2010-2013年的統計里約占64%［4］。而且研究表明真菌含有大量次級代謝產物生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters）［5］，但在實驗室或者人工培養條件下，真菌大部分功能基因簇通常處于沉默狀態。通過改變培養基組成、改變發酵條件（如培養容器）以及加入小分子化合物（如前體小分子、酶抑制劑等）等豐富真菌代謝產物多樣性的方法越來越受到研究者的關注［6］。

新化合物發現的方法學研究正在引領海洋微生物天然產物研究的新浪潮?；谫|譜的分子網絡（molecular networking，MN）是一種可視化計算策略［7］。結構相似的化合物在質譜測試中會裂解產生相似的碎片離子，通過計算機算法計算樣品經液相色譜-串聯質譜分析（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）后得到的二級質譜的相似度，依據相似度將質譜信息整合成一種可視化的分子網絡圖。MN有利于快速、大規模地鑒定已知化合物、相似化合物以及挖掘新化合物。近年來，隨著全球天然產物社會分子網絡（Global Natural Product Social Molecular Networking，GNPS）數據庫的開放使用，借助來自全球的化合物及其譜圖積累，GNPS逐漸成為研究天然產物的重要MN工具［8］。如Nie等［9］將生物活性耦合LC-MS/MS和GNPS，高效地評估挖掘來自多種海洋真菌提取物的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）抑制活性和抗氧化活性化合物。

土曲霉（Aspergillus terreus）屬于子囊菌門（Ascomycota）散囊菌綱（Eurotiomycetes）散囊菌目（Eurotiales）發菌科（Trichocomaceae）曲霉屬（Aspergillus），是一種廣泛存在于海洋和陸地的真菌。丁內酯類和土震素類化合物是土曲霉次級代謝產物中的特征代謝產物［10］，研究者發現丁內酯類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑制葡萄糖苷酶、抑制葡萄糖醛酸酶等活性［11-13］，可通過抗炎、抑制細胞周期素依賴蛋白激酶5、促進軸突生長等多種機制實現神經保護作用［14-17］；土震素類化合物具有顯著的AChE抑制活性［18］。本實驗室于前期研究篩選出一株分離自南海珊瑚的海洋土曲霉C23-3，其代謝產物具有一定抗氧化、抑菌和AChE抑制活性且高產丁內酯Ⅰ［19］?？紤]到這株菌的代謝產物及活性可能在抗阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s disease，AD）等神經退行性疾病藥物研發中具有較好研究價值，值得深入挖掘其代謝潛力。

考慮到土曲霉主體活性產物丁內酯I（butyrolactone I）的生源合成途徑［20-21］，本研究選用小分子前體酪氨酸/4-羥基苯丙酮酸的類似物（3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸和3，4-二羥基苯丙酮酸）、異戊烯基轉移酶的底物（萜類側鏈供體金合歡醇和法尼焦磷酸銨鹽（farnesyl pyrophosphate ammonium salt，FPP））、L-硒代蛋氨酸以及氧化脅迫劑（H2O2）和亞硫酸氫鈉甲萘醌（menadione sodium bisulfite，MSB）共9種化學誘導劑對菌株 Aspergillus terreus C23-3 進行誘導培養，結合LC-MS/MS和GNPS研究化學調控對菌株次級代謝的影響，以期誘導菌株C23-3產生產量更高或多樣性更豐富的丁內酯類等代謝產物，為后續篩選和開發利用具有AD活性的先導化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3（GDMCC No.60316）采自湛江徐聞珊瑚保護 區，現保存于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基 海水馬鈴薯培養基：馬鈴薯汁500.0 mL（由馬鈴薯200.0 g煮熟過濾而成）、蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、海水晶20.0 g；固體培養基需加入瓊脂20.0 g，加水定容至1.0 L。糙米培養基：糙米833.3 g、海水晶 20.0 g，加水定容至1.0 L。pH均為自然，1×105Pa滅菌20 min備用。

1.1.3 主要試劑與儀器 誘導劑：3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、L-硒代蛋氨酸、H2O2、MSB、金合歡醇和FPP。用5%稀鹽酸（HCl）或二甲基亞砜（DMSO）或無菌水溶解，于超凈臺經0.22 μmol/L濾膜過濾備用。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二苯代苦味酰自由基（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine，ATCh）、5，5'- 二硫代二硝基苯甲酸（dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB），合肥博美生物科技有限責任公司；24孔板，無錫耐思生物科技有限公司；薄層層析板Silica gel 60 F254，德國默克公司；LC-MS/MS分析用試劑為Fisher質譜純，其他試劑及材料均為國產分析純。

多功能紫外透射儀，上海精科實業有限公司；霉菌培養箱及生物安全柜，上海博訊實業有限公司醫療器械廠；Thermo Finnigan液相色譜-二極管陣列檢測器- LCQ Advantage MAX離子阱質譜聯用儀，賽默飛世爾科技有限公司；旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備種子 將菌株C23-3凍存管置于溫度28℃、濕度80%的霉菌培養箱活化過夜；將菌種接種到預先裝有200 mL滅菌海水馬鈴薯固體培養基的錐形培養瓶中培養3-4 d，待菌落孢子生長茂盛備用。

1.2.2 誘導菌株 使用0.85%的無菌生理鹽水將1.2.1培養的菌種孢子洗下，搖勻。海水馬鈴薯培養基和糙米培養基均使用24孔板，每孔加入2 mL培養基和200 μL孢子懸液，28℃、濕度80%培養 3 d。

3 d后，誘導組根據設置的誘導劑濃度（如圖1標注所示），向菌株培養物加入化學誘導劑；對照組根據誘導劑的溶劑（5% HCl、DMSO和無菌水），向菌株培養物加入與誘導劑等體積的溶劑；空白組為不加誘導劑或溶劑的菌株培養物。每個條件設置2個復孔，24 孔板置于霉菌培養箱中繼續培養，每天觀察培養物形態并拍照記錄。

1.2.3 提取次生代謝產物 分別在第14天和28天提取菌株次級代謝產物。先將用于微量發酵的24孔板冷凍干燥。對于液體培養物，每孔加入2 mL甲醇浸泡過夜，將孔內物質全部轉移至離心管，加入2 mL甲醇洗凈孔內殘留后轉移至離心管合并，功率500 W超聲提取30 min，靜置過夜取上清液備用；沉淀則加入4 mL甲醇，超聲提取步驟同上，重復2次；將總的上清液過濾膜（孔徑0.45 μm）濃縮干燥、稱重，4℃ 冷藏備用。對于固體培養物，每孔加入1 mL甲醇浸泡過夜；將孔內容物全部轉移至離心管后加3 mL甲醇洗凈孔內殘留，剩余操作同液體培養物的提取。

1.2.4 薄層層析分析、生物活性自顯影及化學顯色 此部分參考張翼等［22］的方法，不同培養基的發酵提取物均以三氯甲烷∶甲醇（體積比為20∶1）為薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）展開劑，分別記錄254、365 nm的紫外圖像，DPPH自由基清除活性與AChE抑制活性自顯影圖像，茴香醛硫酸顯色及鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色圖像。

1.2.5 LC-MS/MS 將各提取物均用色譜甲醇配成等體積樣品溶液進行液質分析。

色譜分析條件：進樣量為20 μL，洗脫條件為：0.00-1.00 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；1.00-8.00 min，30%-99%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；8.00-12.00 min，99%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；12.00-12.20 min，99%-30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；12.20-15.00 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸），流速0.6 mL/min。DAD檢測器信號采集波長為190-600 nm，監測波長為210 nm、254 nm、280 nm、310 nm和360 nm。色譜柱為Phenomenex Kinetex C18 100?反相色譜柱（100×4.60 mm，5 μm）。

質譜檢測條件：質量掃描范圍設置為m/z 100-2 000，電噴霧離子化，正離子模式，離子源電壓：4 kV，毛細管溫度：325℃，二級質譜觸發信號強度閾值1×105CPS（Count Per Second），碰撞能量：35 eV，離子傳輸管電壓：10 V。

1.2.6 分子網絡的創建和可視化分析 使用Proteo Wizard軟件轉換原始液質數據文件的格式，然后上傳至GNPS數據庫計算分析，將分析結果導入 Cytoscape 3.7軟件繪制分子網絡圖。利用GNPS的二級質譜相似度匹配功能可注釋樣品所含的已知化合物，并根據分子網絡圖中不同節點的關系，結合質譜數據，來發現已知化合物的類似物或衍生物。

2 結果

2.1 誘導前后菌株表觀形態變化

菌株C23-3在海水馬鈴薯液體培養基條件下，如圖1-C所示，空白組的菌絲體呈現乳白色，邊緣呈現灰黑色；如圖1-A所示，分別添加3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸后，隨著誘導劑濃度的增大，菌株的菌絲體生物量無明顯變化，菌絲體由淺黃色變成淺棕色；而添加MSB、H2O2、FPP以及無菌水的組（圖1-B-C），菌膜邊緣黑色部分增加。

菌株C23-3在糙米培養基條件下，如圖1-C所示，空白組菌絲體呈棕色；如圖1-A所示，分別添加3-氨基-L-酪氨酸和3-羥基-L-酪氨酸后，實驗組各個濃度的菌絲體生物量變少且顏色變淺；加入3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、金合歡醇后，菌絲體生物量減少；如圖1-B所示，添加L-硒代蛋氨酸后，菌株產生少量白色菌絲體。

圖1 菌株C23-3化學調控前后生長形態（培養28 d）Fig.1 Growth morphology of strain C23-3 before and after chemical regulation（cultured for 28 days）

同等培養條件下，培養14 d的菌株表現形態與培養28 d的無明顯差異。綜上所述，在3-氨基-L-酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3，4-二羥基苯丙酮酸、金合歡醇和L-硒代蛋氨酸誘導前后菌株C23-3外觀形態上產生了明顯變化，而菌株形態變化與次級代謝產物通常密切相關［23-24］，為了驗證誘導劑引起的次生代謝變化，本文對菌株提取物進行了TLC指紋圖譜與生物活性自顯影的分析。

2.2 誘導前后TLC指紋圖譜比較

對添加化學誘導劑前后的菌株提取物進行了不同波長下的吸收/熒光斑點、茴香醛顯色斑點、DPPH自由基清除活性斑點、三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色斑點和AChE抑制活性斑點的TLC指紋綜合比較，如表1及圖2所示，添加化學誘導劑前后菌株TLC指紋圖譜發生了顯著變化。在糙米培養基中，3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）、3-羥基-L-酪氨酸（10 mmol/L）、3-硝基-L-酪氨酸（10 mmol/L）、3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）、金合歡醇（1 μmol/L）、MSB（10 μmol/L）、H2O2（1 mmol/L）、FPP（5 μmol/L）和L-硒代蛋氨酸（61 mmol/L）這9種誘導條件下代謝產物更豐富或發生變化，且具有一定生物活性。而海水馬鈴薯液體培養基由于代謝產物過少，未做進一步分析。

圖2 菌株 C23-3 化學調控前后發酵產物 TLC 指紋圖譜（糙米培養基）Fig.2 TLC fingerprints of strain C23-3 fermentation products before and after chemical regulation（brown rice medium）

2.3 誘導前后代謝產物總體多樣性比較

利用LC-MS/MS對糙米培養基上經化學誘導后菌株微量發酵代謝產物進行分析，結合GNPS數據庫和Cytoscape等軟件做分子網絡圖。首先使用同一誘導劑的不同條件（改變濃度或培養時間）及其對應空白組和對照組的菌株提取物單獨做分子網絡分析，然后從9種誘導劑中匯總次生代謝產物豐富或有明顯變化的培養條件再做分子網絡（圖3）?；鍒D（base peak chromatograms，BPC）是將每個時間點質譜圖中最強離子的離子強度連續描繪而得的圖譜，結合分子網絡中的節點數量、大小、比例分布等，二者在一定程度上可反映菌株代謝產物的總體多樣性。

在分子網絡圖中，一個節點代表一種化合物（不排除為同分異構體的集合），實質上是液質數據中具有相同整數質荷比、視為相同二級質譜圖的所有母離子的集合，其上標注的質荷比為采集的全部母離子質荷比的均值；化合物二級質譜之間的相似性用余弦值（即cosine值，范圍為0-1）表示，余弦值與相似性成正比，節點之間的連線粗細與節點之間的cosine值正相關；節點不同顏色的扇形分布代表化合物不同來源的相對含量；節點的大小代表不同化合物的總離子強度。如圖3所示，分子網絡圖直觀的顯示某些代謝產物在不同的培養條件下分布不同，有的有明顯的偏向性，只在少數甚至個別條件下才產生，如最大離子簇中m/z 461.259、459.243、551.168等節點，在Cytoscape軟件中點擊相應的節點可瀏覽詳細信息。根據樣品與GNPS數據庫里收錄化合物二級質譜的相似性匹配（cosine值大于0.7），判斷菌株C23-3的已知產物主要有丁內酯Ⅰ（compound 1）、土震素B（compound 2）、洛伐他?。╟ompound 3）和和一個相對微量成分洛伐他汀羥酸（compound 4，洛伐他汀內酯鍵開環產物）。

?

對于這四種特征化合物，根據GNPS提取的化合物的出峰時間和分子量信息，在BPC（圖4）中可找到對應的色譜峰及質譜信息（丁內酯Ⅰ：［M+H］+m/z 425，保留時間在8.35 min；土震素B：［M+H］+m/z 527，保留時間8.84 min；洛伐他?。海跰+H］+m/z 427，保留時間10.39 min；洛伐他汀羥酸：［M+H］+m/z 445，保留時間9.43 min；其二級質譜見圖5-7），發現在不同培養條件下它們的產量有較大變化。

除了上述已知代謝產物的變化外，實驗中也觀察到一些未知成分的變化，在圖4中用箭頭標注了相應樣品中較獨特的成分。

圖4 菌株C23-3不同培養條件下代謝產物的液質聯用基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatograms of the metabolites of strain C23-3 under different culture conditions

如加入3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）后，在12.63 min產生基峰為m/z 736.43的化合物；加入3-羥基-L-酪氨酸（10 mmol/L）后，在13.07 min產生基峰為m/z 338.80的化合物；加入3-硝基-L-酪氨酸（10 mmol/L）后，在7.71 min產生基峰為m/z 513.04的化合物；加入3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）后，在10.05 min和11.12 min分別產生基峰為m/z 520.30和529.25的化合物；而空白組、試劑對照組以及其他誘導組在相同保留時間則沒有，推測這些前體小分子可能對菌株的代謝產物產生影響。

添加FPP（5 μmol/L）后，在7.33 min（基峰m/z 422.99）和11.24 min（基峰m/z 429.25）的化合物強度比其他組略高；添加了金合歡醇的實驗組在13.49 min的化合物（基峰m/z 409.24）與其他組有所區別，由此推斷萜類側鏈供體FPP和金合歡醇可能刺激菌株C23-3提高部分化合物的產量。

添加MSB（10 μmol/L）后，在10.64 min產生基峰為m/z 459.26的化合物；添加H2O2（1 mmol/L）后，在12.84 min產生基峰為m/z 338.21的化合物，推測氧化劑MSB和H2O2對菌株C23-3可能造成氧化脅迫，刺激其代謝產物發生變化。

加入L-硒代蛋氨酸（61 mmol/L）的實驗組與其他組的BPC無顯著差異，與TLC結果有一定差異，推測可能某些代謝產物在正離子條件下未能檢測到。

綜上所述，這9種化學誘導劑可對菌株C23-3代謝產物的種類或產量產生不同程度的影響。

2.4 誘導前后特征代謝產物衍生物分析

除了通過與數據庫收錄的二級質譜匹配以指認已知化合物，GNPS還可利用二級質譜相似性來分析樣品中各代謝產物之間的關系，由已知化合物節點來發現其可能的同族化合物。

根據圖3中通過對已知化合物Compounds 1-4相連的主要節點的二級質譜（圖5-圖7）的分析，主要是其母離子和碎裂離子與已知化合物相應離子質荷比的關系，推測這些化合物可能為相應已知化合物異構體或由其脫水、脫氫、脫氧或降碳而來。與質荷比為m/z 425.027的丁內酯Ⅰ結構相似的節點有4個（Compounds 5-8），質荷比依次為m/z 425.028（和丁內酯I二級質譜相似又有顯著不同，雖未與其聚在同簇，但推測可能為其異構體）、m/z 423.01（丁內酯I脫氫產物）、m/z 441.046（Compound 5加氧產物）和m/z 407.021（丁內酯I脫水產物）；與質荷比為m/z 527.166的土震素B結構相似的節點有2個（Compounds 9-10），質荷比分別為m/z 511.169（土震素B脫氧產物）和m/z 513.128（土震素B降碳產物，如甲氧基變為羥基）；與質荷比為m/z 427.236的洛伐他汀結構相似的節點有3個（Compounds 11-13），依次是m/z 409.247（脫水產物）、m/z 411.184（脫氧產物）和m/z 429.256（加氫產物）。其中部分化合物在上文BPC譜圖比較中也是獨特色譜峰。

圖3 菌株C23-3不同培養條件下代謝產物基于二級質譜聯系的分子網絡圖及局部放大圖Fig.3 Molecular network and its partial enlarged diagram of the metabolites of strain C23-3 under different cultural conditions based on MS2 relationships

圖5 Compound 1及其可能衍生物的二級質譜圖Fig. 5 MS2 spectra of compound 1 and its possible derivatives

圖7 Compounds 3、4及其可能衍生物的二級質譜圖Fig.7 MS2 spectra of compounds 3，4 and their possible derivatives

為了進一步分析9種誘導劑對菌株C23-3丁內酯類、土震素類及洛伐他汀類特征代謝產物多樣性及產量的影響，對上述GNPS注釋或推測的該三類化合物Compounds 1-13的提取離子色譜圖（Extracted ion chromatogram，EIC）相應化合物峰面積進行了計算和比較。

圖6 Compound 2及其可能衍生物的二級質譜圖Fig.6 MS2 spectra of compound 2 and its possible derivatives

結果（圖8）顯示，添加誘導劑金合歡醇（1 μmol/L）的丁內酯Ⅰ產量相對最多，FPP（5 μmol/L）以及MSB（10 μmol/L）誘導組代謝產物中的丁內酯Ⅰ略少于金合歡醇組，但FPP組和MSB組的丁內酯類的種類和產量更豐富；FPP（5 μmol/L）誘導組的土震素B產量和種類在這九組里相對較優，其次是3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）誘導組。而洛伐他汀類代謝產物在3，4-二羥基苯丙酮酸（1 mmol/L）、3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）和硒代蛋氨酸（61 mmol/L）組中產量與多樣性較優。綜上所述，菌株C23-3在不同化學誘導劑的作用下，菌株的特征產物（丁內酯Ⅰ、土震素B和洛伐他?。┘捌淇赡苎苌锏姆N類和產量發生了較大變化。

圖8 菌株C23-3不同化學調控條件下的代謝物中特征產物及其衍生物的含量Fig.8 Contents of the characteristic products and their derivatives in the metabolites of strain C23-3 under different chemically regulated conditions

3 討論

研究表明，很多微生物雖然具有豐富的次生代謝產物合成基因簇，但在實驗室培養條件下相當部分處于沉默狀態［25］，活性菌株的潛力有待進一步挖掘。前體導向生物合成技術有利于在已知的先導化合物基礎上開展結構優化與改造，如黃婷婷［26］向吡啶霉素鏈霉菌NRRL B-2517的野生型菌株飼喂與天然底物3-羥基吡啶羧酸結構類似的芳香羧酸和氨基酸，分離得到幾種新的吡啶霉素結構類似物。本研究考慮了不同基礎培養基和多類型化學調控手段（包括化合物骨架的小分子前體類似物、萜類側鏈供體類似物、氧化脅迫及硒代氨基酸）的綜合運用，以利于發現更好的誘導條件。

實驗結果證明不同類型的化學誘導劑可對菌株C23-3代謝產物和生物活性的確能產生不同程度的影響，特別是丁內酯類、土震素類和洛伐他汀類化合物的多樣性和產量發生了較大的變化，丁內酯類和土震素類化合物被發現具有一定的抗氧化、神經保護、抗神經炎癥和乙酰膽堿酯酶抑制活性［15-18］，本研究為抗阿爾茨海默氏癥等活性的新化合物發現提供了基礎。

另一方面，本研究中不同的調控條件包括一些前體類似物雖然改變了菌株的代謝，但在質譜中并未明顯檢測到含有特定飼喂前體結構片段的預期丁內酯衍生物，推測可能是由于培養基中原有的天然前體（如酪氨酸、苯丙氨酸、對羥基苯丙酮酸和二甲基烯丙基二磷酸）與相應合成酶系的親和力更強，故菌株的特征代謝產物丁內酯Ⅰ仍是主產物，可能抑制了目標化合物的產生，實驗中發現的代謝產物改變可能是調控物對菌株代謝產生了間接影響。如李亞偉等［27］利用真菌有機相粗提物誘導纖維堆囊菌，發現加入的誘導物對該菌生長和營養利用無顯著影響，而可能通過小分子信號物質改變關鍵酶的活性，調整代謝途徑，進而影響目標產物埃博霉素的產量。在今后的研究中通過改變前體類似物的加入時間或加入相應的酶抑制劑，有可能會促進相應衍生物產生，這有待進一步研究。

本研究也顯示基于LC-MS/MS的GNPS分子網絡對于挖掘菌株多樣性次生代謝產物的優點，可對已知化合物進行注釋，并基于二級質譜相似性發現多樣化的衍生物，比較不同條件下代謝產物差異。但我們也注意到，這一研究工具還有待繼續完善，有些情況下仍需要輔以人工判斷，但隨著數據庫中特定類型化合物二級質譜的積累，它的識別、聚類能力也會越來越強。

4 結論

菌株C23-3在不同化學誘導劑作用下，其TLC紫外斑點、化學顯色及生物活性斑點對比空白組和對照組有顯著變化；利用GNPS和LC-MS/MS分析其代謝產物，發現9種誘導劑可刺激菌株C23-3代謝產物的種類和產量發生不同程度的變化，其中金 合 歡 醇（1 μmol/L）、FPP（5 μmol/L）、MSB（10 μmol/L）和3-氨基-L-酪氨酸（1 mmol/L）等 4 種誘導劑效果較好，可刺激菌株產生多樣化的丁內酯類化合物和土震素類化合物。這為抗氧化或乙酰膽堿酯酶抑制活性化合物的深入研究提供基礎，對抗AD藥物的研發具有一定的科學意義。