棉花GhD6PKL2的克隆及功能驗證

劉媛媛 楊冬杰 左東云 程海亮 張友平 呂麗敏 王巧連 宋國立

（中國農業科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室，安陽 455000）

棉花是重要的經濟作物，棉纖維品質的好壞直接關系到其經濟產量和使用價值。因此，篩選出棉花纖維發育相關基因，研究不同類型的相關基因在棉纖維發育中的作用，對纖維品質改良具有重要意義。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STPK）在細胞代謝、基因表達、細胞的生長分化及逆境脅迫響應方面［1］發揮重要作用。了解STPK在棉纖維發育中的作用，研究他們的表達特征將為棉纖維形成的遺傳機制提供更寬廣的理論基礎。

STPK的活性中心由11個保守的亞結構域組成，通過結合ATP及Mg2+，可以轉移ATP的可-磷酸到絲氨酸蘇氨酸的羥基上。該活性中心由2個區（N端區域和C端區域）及二者之間的Linker（位于亞結構域V）組成［2］。亞結構域Ⅰ，序列特征為：GxGxxG，是ATP結合的位點；亞結構域Ⅱ中的賴氨酸（K）用于磷酸基的轉移［3］；亞結構域Ⅵ（序列特征為：DLKPEN）中的天冬氨酸（D），可以通過Mg2+鹽橋與ATP相互作用；位于近C端的亞結構域Ⅶ、Ⅷ為STPK的重要活性位點。亞結構域Ⅶ作為Mg2+結合位點，其序列特征為：DFD（天冬氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸）或DFG（天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸）；亞結構域Ⅷ中高度保守的APE序列可以作為蛋白激酶活性位點的標志序列；亞結構域Ⅷ緊鄰N端有一個T-loop，其保守序列為：SxSFVGTxEY。研究表明T-loop的磷酸化導致α-C helix構象的改變，從而使激酶處在穩定的開放狀態用于與受體結合。亞結構域Ⅶ和Ⅷ活性位點間的氨基酸數目不定、相似性不高，屬于T-loop及Mg2+結合Loop之間的插入序列［4］。Linker區域作為連接體，可通過C、N兩端間一定程度的旋轉，控制ATP結合口袋的開關［5］。

作為最主要的一類蛋白激酶，STPK又可以分為CaMK（鈣調依賴蛋白激酶）組、CMGC（包括絲裂原活化蛋白激酶-MAPK、周期素依賴蛋白激酶-CDK）組和AGC組［6］。其中，AGC組又可以分為5個亞組，AGC Ⅷ、AGC Ⅶ、AGC Ⅵ、AGC other 和PDK1［7］。D6PKs（D6PK，D6PKL1-D6PKL3）則屬于AGC Ⅷ亞組的成員［8］。研究表明，AGC Ⅷ在Ⅶ亞結構域處為真核生物中特有的DFD序列，而非真核生物外的其他激酶類型為DFG序列［6］；擬南芥基因組中有23個AGC Ⅷ激酶基因［9］。這些激酶中有和生長素運輸相關的，有和依賴生長素運輸的發育進程相關的：向光素phot1和phot2是一類藍光受體［10］，在子葉節向光性彎曲中發揮一定作用［11］；WAG1或WAG2過表達后，植物表現出根尖部位PIN蛋白的大量聚集，影響擬南芥根的發育［12］；PINOID（PID）受PDK1的磷酸化作用而被激活，而后通過進一步磷酸化生長素運輸載體PIN蛋白，參與生長素的極性運輸和分布［13］。AGC1.5和AGC1.7影響花粉管的定向生長［14］；UCN（AGC2-3），通過與轉錄因子的作用，調控珠被發育等的極性平面生長過程［15］；D6PKs家 族（D6PK、D6PKL1、D6PKL2、D6PKL3）主要通過磷酸化PIN參與擬南芥生長素運輸［8］及子葉節的向光性等過程［16］。另外，AGC Ⅷ蛋白激酶在其他生長發育進程中的作用也在陸續研究和報道中。蕃茄AGC1激酶基因——Adi3為哺乳動物中Akt/PKB的同源基因，2個基因的編碼蛋白均負調控細胞的程序性死亡［17］。類病毒誘導的蛋白激酶（protein kinase- viroid induced，PKV）屬于AGC Ⅷ蛋白激酶，蕃茄過表達該激酶基因，影響維管組織發育、根的形態建成，使植株表現出生長遲緩、不育等生長狀態［18］。擬南芥AGC1-4激酶基因通過調控細胞分裂和胚胎發育，進而調控種子大?。?9］。

盡管AGC Ⅷ蛋白激酶在植物生長發育中發揮一定作用，但該類基因在棉纖維生長發育階段中的作用所知甚少，該激酶信號通路是否參與調控棉纖維的各發育階段還有待研究。

本研究分析GhD6PKL2在棉纖維不同發育時期的表達量情況；通過過表達轉化擬南芥，觀察轉基因擬南芥表型性狀并推測其可能的功能。為更好地理解STPK蛋白激酶在擬南芥表皮毛、根的生長發育，以及棉纖維發育機制方面提供新的可借鑒信息，為棉纖維發育理論奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：陸地棉遺傳標準系TM-1、哥倫比亞野生型擬南芥及本氏煙草；菌株：DH5a、LBA4404以及Y2H Gold；所用到的限制性內切酶如Sal I、EcoR I、BamH I等購買于TOYOBO公司；重組酶如Exnase II等購買于鄭州威展生物公司；RNA提取試劑盒購買于天根公司；逆轉錄試劑及定量PCR所需的熒光染料試劑購買于abm公司；膠回收試劑盒購買于QIAGEN公司。植物表達載體pRI101由棉花生物學國家重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及cDNA的合成 分別對陸地棉TM-1不同發育時期（-3、-1、0、1、3、5、7、10、15、20和30 d）的胚珠或棉纖維進行取樣，采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit（DP441）多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進行RNA提取。根據5×All-In-One RT MasterMix（abm）試劑盒說明書進行反轉錄試驗，獲得的cDNA置于-20℃保存備用。

1.2.2 GhD6PKL2的克隆及生物信息學分析 本研究篩選了一個STPK中AGC VIII蛋白激酶家族成員，命名為GhD6PKL2。以TM-1開花后3 d胚珠cDNA為模板，設計擴增引物（表1）克隆目的基因。使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列多重比對分析；使用GSDS2. 0（https://gsds. cbi. pku.edu. cn/）在線軟件進行基因結構分析；使用NCBI的CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）程序進行蛋白保守結構域的預測；利 用ExPASy- Protparam（https://web.expasy.org/cgi-bin/ protparam/protparam）程序進行預測蛋白的理化性質及親水性/疏水性分析。利用TMHMM2. 0 SERVER（https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線進行蛋白的跨膜結構預測；利用人工網絡神經 算 法SignalP5. 0（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對其信號肽進行預測；最后使用NetPhos3. 1（https://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）程序進行預測蛋白的磷酸位點分析。

1.2.3 GhD6PKL2的表達模式分析 以不同發育時期的棉纖維cDNA為模板，利用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）試劑盒及Bio- Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共44個循環；65℃ 5 s；95℃ 15 s；60℃ 15 s。每個樣品同時進行3次生物學重復。用2-ΔΔCt相對定量法，以Histone 3（AF024716）［20］為內參基因（表1），分析目的基因的相對表達量。

1.2.4 GhD6PKL2的亞細胞定位 利用同源重組方法，構建pRI101-GhD6PKL2-GFP亞細胞定位載體。通過農桿菌轉化后注射煙草葉片，2-4 d后通過激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 STED 3X）觀察GFP熒光在細胞中的定位分布情況。

1.2.5 GhD6PKL2的轉錄活性分析 將構建的誘餌蛋白表達載體pGBKT7-GhD6PKL2分別涂布于SDtrp、SD-trp/X-α- gal以及SD- trp/X- α- gal/AbA培養基上；同時涂布陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）于SD-trpleu/X-α-gal培養基；涂布空載體pGBKT7于SD-trp培養基。30℃培養2-5 d至各培養基長出明顯菌落，觀察各菌落生長狀態。

1.2.6 GhD6PKL2的過表達轉化擬南芥 將GhD6PKL2的ORF構建到含35S啟動子的pRI101載體上，利用農桿菌LBA4404介導及浸花法轉化擬南芥，通過卡那霉素篩選及分子檢測、RT- PCR及Actin（鑒定檢測引物見附表1）的鑒定，獲得目的基因較穩定遺傳的T3代轉基因擬南芥，觀察其根生長情況，并用體式顯微鏡觀察其表皮毛表型，進一步推測該基因可能的功能。

表1 本研究所用到的引物列表Table1 Primers used in this study

2 結果

2.1 GhD6PKL2的克隆及序列分析

從陸地棉TM-1中克隆GhD6PKL2，其全長3 578 bp，含有1個內含子（圖1-A），CDS長度為1 362 bp，編碼453個氨基酸。CDD程序預測GhD6PKL2蛋白序列的71-434位氨基酸處存在STPK活性位點；多重序列比對結果（圖1-B）同時驗證顯示，GhD6PKL2核苷酸序列中存在11個STPK家族典型的活性位點。上述結果表明，GhD6PKL2屬于STPK家族成員。ExPASy-Protparam分析顯示，該蛋白理論的相對分子質量為49.74 kD，等電點為6.17，蛋白質可能的分子式為C2223H3463N595O667S17，預測脂肪酸系數為78.98，總平均親水性為-0.257（正值為疏水，負值為親水）；在GhD6PKL2編碼的453個氨基酸中，47個為正電荷（Arg+Lys）氨基酸，53個為負電荷（Asp+Glu）氨基酸，不穩定系數為53.14＞40。說明GhD6PKL2可能是一個不穩定的、酸性親水蛋白。TMHMM2. 0 SERVER程序預測GhD6PKL2不存在跨膜結構，為胞外蛋白（圖1）。利用人工網絡神經算法SignalP5. 0的默認參數，預測到該蛋白N端1-70個氨基酸中不存在信號肽。使用NetPhos3.1進行GhD6PKL2磷酸位點分析（圖2），預測結果顯示目的蛋白可能含有42個絲氨酸、14個蘇氨酸、2個酪氨酸，并且絲氨酸蘇氨酸磷酸化可能的位點多預測在N端（0-60氨基酸）序列處，推測該激酶基因可能通過這些磷酸化位點處發生的磷酸化作用，參與調控了棉纖維生長發育的生理生化過程。

圖1 GhD6PKL2序列分析及蛋白比對Fig.1 Analysis of the GhD6PKL2 sequence and protein sequence alignment

圖2 GhD6PKL2蛋白的磷酸位點預測Fig.2 Pridiction of phosphorylation sites in GhD6PKL2

2.2 GhD6PKL2在不同發育時期的表達模式分析

qRT-RCR分析GhD6PKL2在不同發育時期的相對表達量（圖3），GhD6PKL2在開花前3 d到開花后5 d的表達量呈現緩慢上升趨勢，開花后10-20 d時表達量顯著升高，并在20 d時表達量達到最大值，而開花后30 d時表達量則呈現顯著下降狀態。該表達趨勢與棉花纖維伸長與細胞壁加厚階段發育情況相吻合，推測GhD6PKL2可能參與棉花纖維伸長與細胞壁加厚階段的發育。

圖3 GhD6PKL2在棉纖維各發育時期的相對表達分析Fig.3 Relative expression level of GhD6PKL2 in different periods at cotton fiber development

2.3 GhD6PKL2的亞細胞定位

在線預測軟件software softberry（https:// www. softberry. com/ berry. Phtm）顯示GhD6PKL2定位在細胞膜上。通過將構建好的pRI101-GhD6PKL2-GFP載體注射煙草葉片發現，GFP熒光在細胞中的發光部位，表明GhD6PKL2確實定位在細胞膜上（圖4）。推測GhD6PKL2蛋白激酶的膜定位結果，可能與其在細胞膜上發揮其激酶作用相關。

圖4 GhD6PKL2的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of GhD6PKL2

2.4 GhD6PKL2的轉錄活性檢測

通過培養，在SD-trp-leu/X-α-gal培養基上的陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T）出現藍色菌斑，陰性對照（pGBKT7- Lam和pGADT7-T）出現白色菌斑；在SD-trp培養基上的空白對照PGADT7-T及誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2均呈現白色菌斑。進一步觀察，發現誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2在SD-trp/X-α-gal及SD-trp/ X-α-gal/AbA培養基上都呈現白色均勻分散的酵母單克隆菌斑，沒有出現藍色菌斑（圖5），說明構建的GhD6PKL2的誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2不存在自激活情況。同時，誘餌載體pGBKT7- GhD6PKL2在SD-trp培養基中呈現的酵母單克隆菌株大小與攜帶空載體的pGBKT7相差不多，基本判斷pGBKT7-GhD6PKL2對酵母細胞無毒性。以上結果表明構建的pGBKT7-GhD6PKL2誘餌載體可以繼續下一步的互作蛋白的篩選驗證工作。

圖5 GhD6PKL2誘餌載體自激活的檢測Fig.5 Detection of transcriptional activity of GhD6PKL2

2.5 轉GhD6PKL2擬南芥的分子鑒定

共得到20株T1轉基因植株，編號為D6PKL2-1、D6PKL2-2…D6PKL2-20。選擇其中的2個株系D6PKL2-1、D6PKL2-2的T3植株用于分子鑒定（圖6）。所有擴增條帶大小與預期完全一樣，表明GhD6PKL2已經整合到擬南芥的基因組DNA中，并且能夠在擬南芥植株中表達形成轉錄本。

圖6 轉GhD6PKL2擬南芥的分子鑒定Fig.6 PCR and RT- PCR analysis of the GhD6PKL2 transgenic plants

2.6 轉GhD6PKL2擬南芥表皮毛表型

利用體視顯微鏡觀察T3代轉GhD6PKL2擬南芥與野生型擬南芥表皮毛生長情況。選擇生長天數相同、生長狀態相近及葉片面積基本一致的T3代D6PKL2的3個株系，比較及分析后發現轉基因擬南芥表皮毛出現較野生型擬南芥表皮毛顯著增多的表型（圖7）。推測GhD6PKL2在擬南芥表皮毛發生及生長發育中可能起到促進作用。

圖7 轉GhD6PKL2擬南芥葉片表皮毛的表型Fig.7 Phynotype of Arabidopsis trichome between GhD6PKL2 trans-genic plants and wide type

2.7 轉GhD6PKL2擬南芥根的表型

萌發野生型擬南芥（點種于MS培養基）及T3代轉基因擬南芥種子（點種于含卡那的MS培養基），至種子剛伸展開2片子葉時（大約萌發后5 d），移入同一皿不加抗生素的、新鮮MS培養基中繼續生長（圖8-A，左邊6株為野生型，右邊6株為轉基因擬南 芥）。7 d后觀察發現轉GhD6PKL2擬南芥表現出主根長度顯著變短、同時側根數目明顯變多的性狀（圖8）；除此之外的其他表型（如生長快慢、植株大小、葉色、根毛等）在觀察時沒有明顯差異。說明GhD6PKL2可能還參與擬南芥主根伸長、側根發育的過程。

圖8 轉GhD6PKL2擬南芥根的表型Fig.8 Phenotype of Arabidopsis main root between GhD6PKL2 trans-genic plants and wide type

3 討論

棉纖維是由胚珠表皮分化、生長而形成的不分支單細胞，與擬南芥葉片表皮毛、根毛同屬于植物腺毛體。研究表明棉花和擬南芥在腺毛體的發育調控機制方面非常相似［21-23］。GaMYB2能使gl1無表皮毛突變體恢復表皮毛表型，證明該基因參與了表皮毛的分化調控［24］。擬南芥過表達GhMYB2能使轉基因擬南芥種子表現出類似于棉花纖維的種皮毛［25］。表明棉纖維與擬南芥確實存在相似的腺毛體發育機制。

GhD6PKL2屬于STPK中AGC VIII亞族- D6PKs的成員。目前對D6PKs的功能也進行了一定的研究。D6PK在側根起始位點強烈高表達，d6pk突變體在側根起始、根的向重力性及腋芽分化等性狀上明顯減弱，表現出和生長素運輸量減少的一致表型。研究報導D6PK和生長素運輸載體PIN蛋白存在互作，二者同時極性共定位在細胞膜上，因此得出D6PK通過直接磷酸化PIN蛋白參與生長素的運 輸［8，26］。通過對生長素極性運輸過程的調控，D6PK也陸續被報道有影響子葉節向光性彎曲［27］及頂端彎曲［28］等作用。有研究表明，該基因在根毛細胞凸起中發揮平面極性作用［29］。除此之外，D6PKL3為該亞家族中分化最大的成員（和該家族中其他3個成員的相似性為60%），在花粉孔徑形成中也發揮一 定作用［30］。

通過氨基酸的序列比對，GhD6PKL2與陸地棉中注釋為STPK-D6PKL2- L（XP_ 016753337. 1）的蛋白有最高相似性（為97.57%），與擬南芥中注釋為AGC1-12（At3g44610）的蛋白相似性為72.41%，可以發現上述2個相似性較高的蛋白均屬于AGC VIII亞族。同時該基因亞結構域VII的序列特征為DFD，表明GhD6PKL2為一個AGC VIII亞族成員。通過序列分析發現，VII和VIII亞結構域附近還存在3個S/TxxxxxS/T序列，該序列為STPK中絲裂原活化蛋白激酶的激酶（MAPKK）在植物中保守的特征序列［31］。因此，通過進一步和擬南芥MAPKK2（UniProtKB/ Swiss- Prot：O80396. 1）進行氨基酸序列比對，發現二者僅存在14.29%的相似性。因此GhD6PKL2非MAPKK成員，確定為一個AGC VIII亞族成員。

亞細胞定位特征在一定程度上可以預測基因可能的功能。植物AGC激酶特有的VII和VIII活性位點間存在一段氨基酸插入數目可變的序列［6-7］，這段無規律的插入序列已經陸續被報道出對激酶的定位有重要影響［4］：擬南芥中AGC VIII激酶的AGC3亞組成員PID，其VII和VIII之間的插入序列與其細胞膜定位相聯系［32］；ADI3是與D6PK相聯系的AGC激酶成員，具有核、內質網雙定位現象［33］。植物特有的AGC VIII激酶亞族的這段插入序列由36-118個氨基酸組成［4］，本研究中GhD6PKL2的VII和VIII間確實存在一段100左右的大插入片段。許多研究結果還表明，磷脂的識別作用是AGC VIII亞族大多數成員極性定位在細胞膜上的一個重要特性［29］。最近的研究結果也表明，AGC激酶家族重要成員PDK1的細胞膜定位，取決于細胞膜上磷脂的積累，在生長素處理時可以促進細胞膜對PDK1的招募［34］。本研究表明GhD6PKL2也為一個細胞膜定位基因。該結果和軟件預測定位結果一致，推測：作為磷酸化生長素運輸載體-PIN蛋白的重要激酶，D6PK及許多AGC VIII家族成員是通過其VII和VIII之間的插入序列、特異性地識別細胞膜上磷脂類分子而在細胞膜上發揮一定的作用。

生長素是植物體內重要的激素，PIN蛋白則是生長素運輸過程中最重要的載體。棉花中克隆出的PIN基因，在棉纖維起始階段發揮顯著促進作用［35］。許多研究表明PIN蛋白介導的生長素運輸過程依賴于蛋白激酶的磷酸化作用［36］，其中，AGC激酶家族成員在磷酸化PIN蛋白進而調控生長素的極性運輸和分布方面具有較顯著作用［37］。轉GhD6PKL2擬南芥較野生型出現了表皮毛數目增多的表型性狀，初步表明擬南芥中過表達該基因，對擬南芥表皮毛發育起正調控作用。由于STPK及AGC等激酶基因在棉纖維發育中的研究還是相對較少，該類蛋白激酶在棉纖維發育通路中的具體調控機制更是不清楚，只能根據該基因所在家族中其他成員已經相對研究清楚的功能、進行轉基因擬南芥表型的可能機制的推測。故結合GhD6PKL2所在的AGC激酶家族中成員的主要生理作用，可以大膽推測：擬南芥表皮毛數量的增多，和過量表達的GhD6PKL2可能會加快磷酸化生長素運輸載體PIN蛋白的運輸活性和速率［8，26-27］有關?；诖?，可以引用Tan等［38］根據哺乳動物中PDK1-AKT信號通路而提出的一個模型來解釋GhD6PKL2和增多的表皮毛數量之間的關系：細胞膜上生物合成的磷脂會在細胞膜基部招募PDK1和D6PK，隨后D6PK在PDK1的磷酸化作用下將信號放大；激活的D6PK進一步磷酸化生長素運輸載體PIN蛋白，從而提高PIN蛋白的生長素運輸能力，最終產生生長素在擬南芥表皮毛分化起始階段發揮一定作用的現象。又因為GhD6PKL2在棉纖維伸長期顯著高表達，推測該激酶信號傳導途徑中，可能還存在其他協同作用的激酶或因子共同又促進了伸長期的發育，因而在棉纖維伸長階段也起到了一定的調控作用，說明GhD6PKL2可能為一個潛在的雙重調控棉纖維發育的功能基因。

本試驗中，過表達GhD6PKL2后，轉基因擬南芥同時表現出了主根顯著變短，側根明顯變多的表型性狀。該試驗側根變多的性狀和之前的一些結論有一致之處：在擬南芥d6pk突變體中，發現生長素運輸量明顯減少，植物的側根起始等活動受到抑制［8，26-27］；擬南芥STPK超家族成員MAPK激酶中，MKK4/ 5- MPK3/ 6組成的信號通路，在生長素介導的側根起始方面也發揮重要作用［39］，該信號通路缺失功能后，即在mkk4 mkk5以及mpk3 mpk6雙突變體情況下，植物生長發育早期側根表現出顯著減少的表型。上述試驗結果表明，包括AGC VIII在內的蛋白激酶基因，在擬南芥側根起始階段發揮一定的正調控作用。本試驗轉基因擬南芥表現出的主根變短和之前的一些研究結論完全不同：PAX/AGC1.3屬于AGC1［40］，同樣可以磷酸化生長素運輸載體-PIN蛋白，通過調控生長素運輸活性進一步影響根部韌皮部的分化及根的形態，但該基因的功能缺失突變體，表現出由于韌皮部分化受阻而導致主根變短的表型［34］。上述試驗結果表明AGC VIII蛋白家族成員，主要是通過調控生長素極性運輸、進一步促進根的伸長生長。對本試驗表現出的主根變短的現象，可以大膽推測原因為：在棉花中過表達該基因可能抑制了主根伸長通路中重要基因的作用，具體原因還要進一步通過該激酶信號通路中可能的協同作用因子的發掘與試驗進行驗證。AGC家族中，其他成員也被報道參與調控根發育及其形態建成。IRE激酶基因在根毛的伸長階段有明顯的GUS啟動子活性，其ire突變體，表現出根毛比野生型短約40%的表型，表明IRE可能正調控根毛伸長［41］；受生長素調控及AtPDK1激活的OXI1（AGC2- 1）定位在根毛部位，PDK1- OXI1在抗氧化和抗病等方面發揮重要作用，沉默OXI1后，導致根毛變短，表明OXI1（AGC2-1）在根毛的生長發育中起到正調控作用［42］。上述結果綜合表明，STPK超家族尤其是AGC VIII激酶亞族成員，主要是通過體內某種復雜的聯合機制配合調控生長素的極性運輸，或促進或抑制調控擬南芥根的生長發育。

本研究表明植物生長發育進程是一個龐大復雜而又精致的互作調控網絡系統，植物表現出的某一形態特征或生理變化，都可能是由很多信號通路共同協作、調控的結果。轉GhD6PKL2植株表現表皮毛數量增多、主根變短、側根數目變多的表型，可能是AGC激酶中多個成員共同調控的生長素極性響應的表現。本研究同時也表明GhD6PKL2不存在自激活情況，可以繼續酵母雙雜交試驗、篩選與之互作的蛋白。故本試驗下一步的工作重點為：檢測該基因的激酶活性、期望在GhD6PKL2蛋白激酶基因的上下游信號分子中探索出棉纖維生長發育的信號通路傳導機制。

4 結論

從陸地棉TM-1中克隆出GhD6PKL2，其定位于細胞膜上，檢測該激酶基因無自激活活性，GhD6PKL2在棉纖維伸長期顯著高表達，過表達轉化擬南芥后，轉基因擬南芥較野生型表現出表皮毛數量增加，同時，主根變短、側根數目增多的表型性狀，推測該基因參與擬南芥表皮毛及主側根的發育，可能為一個潛在的棉纖維發育相關基因。