巴山榧樹枝和葉提取物的抗氧化能力、抑菌活性與揮發性成分

王小河 辜夕容 祁順菊 李杰 崔瑤 李得霞 楊莉薈

（西南大學資源環境學院，重慶 400715）

巴山榧樹（Torreya fargesii Franch.），紅豆杉科（Taxaceae）榧樹屬（Torreya）常綠喬木或小喬木，第三紀孑遺植物［1］，是我國特有的優良珍稀木本油料、香料、用材和園林綠化樹種。巴山榧樹木材紋理直、結構細，有彈性和香氣，不開裂，不反翹，經久耐用，且樹形優美，枝和葉的汁液有使人愉悅的濃郁氣味。其假種皮可提取高級芳香油，種子含油49.6%，其中不飽和脂肪酸81.2%，以亞油酸（44%）和油酸（34.5%）為主，飽和脂肪酸以棕櫚酸（8.3%）和榧樹屬特征性成分山俞酸（5.5%）為主［2］，成分及含量與香榧相似，為優質木本植物油，可食用或工業用。

目前對巴山榧樹的研究多集中在地理分布、種群結構和遺傳多樣性等方面［3-5］，對巴山榧樹的功能性成分及其藥食用價值研究極為少見。人們在對其同屬樹種香榧（T. grandis cv. Merrillii）、長葉榧樹（T. jackii）和日本榧樹（T. nucifera（L.）Sieb. et Zucc）的研究中發現，這些樹種具有良好的藥食用價值。如香榧的葉富含黃酮和多酚類物質，具有抗氧化和抗疲勞功能［6］，葉的正丁醇提取物可降低小鼠血糖和血脂［7］，假種皮的正丁醇提取物可抑制腫瘤生長［8］，種子油對動脈硬化有預防作用［9］；長葉榧樹的葉提取物含抗腫瘤的反式瓔珞柏酸［10］，莖粗提物有降壓和擴血管功能［11］；日本榧樹的葉揮發性成分能抑制真菌和細菌生長［12］，樹皮提取物富含萜類和黃酮類，具有驅蟲和抗病毒作用［13］，種子油能驅蟲并改變脂質代謝［14］。

巴山榧樹的枝、葉、假種皮等常被用于治療咳嗽、風濕、腸道寄生蟲病，但其作用機理尚不明確，科學性有待考證。雖然Zhou等［15］發現巴山榧樹的假種皮提取物中總黃酮和總酚含量較高，其抗氧化效果優于市售BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）和抗壞血酸，但對巴山榧樹枝和葉的活性成分與功能研究目前尚未見報道。鑒于同屬其他植物具有良好的藥食用功效，且野生巴山榧樹枝葉流傷具特殊香氣、極少有病蟲危害等現象，推測巴山榧樹應含一定的活性成分而具有抗氧化活性與滅菌能力。因此，研究以巴山榧樹的枝和葉為材料，測定其中揮發性成分以及枝、葉提取物的抗氧化活性與抑菌效果，以探明巴山榧樹枝和葉的活性成分與功能，為開發利用我國特有珍稀植物資源巴山榧樹提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2019年8月，分別在重慶市的巫山縣竹賢鄉福坪村1組三叉溝（110°5'30″ E，31°17'11″ N，海拔1351 m）和開州區雪寶山國家森林 公 園（108°50'14″，N31°35'33″，海 拔1 250 m）的巴山榧樹分布區，于20年樹齡巴山榧樹樹冠中上部外圍剪取生長健壯、無病蟲危害、直徑約2 cm、長度約30 cm的2年生枝條，放入有干冰的泡沫保溫箱中帶回實驗室。經西南大學林學專業辜夕容教授鑒定，所采材料來自巴山榧樹（Torreya fargesii Franch.）。將上述材料按采集地點和部位分成不同地點的樹枝和樹葉，其中樹枝為2年生枝，樹葉為當年生葉。將巴山榧樹枝和葉用洗滌劑洗滌、自來水沖洗干凈后，去離子水沖洗3次，瀝干水分，分裝于牛皮紙信封內，105℃殺青30 min，60℃烘干至恒重，粉碎過0.25 mm篩備用。

抑菌試驗所用的材料為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由西南大學資源環境學院微生物學實驗室李春明高級實驗師提供。

1.1.2 試劑 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂（生物純，購于Sigma公司）；過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵（七水）、30%過氧化氫、無水乙醇、甲醇、氯化鈉等均為分析純。

1.1.3 儀器與設備 優普超純水器（UPC-Ⅱ-010T，成都優普儀器設備有限公司）、萬分之一分析天平（FA2004B，上海精密儀器儀表有限公司）、電熱恒溫干燥箱（202-2A型，蘇州江東精密儀器有限公司）、多功能粉碎機（BJ-150，杭州德清拜杰電器有限公司）、防爆旋轉蒸發器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）、離心機（D-37520 Thermo Fisher，Thermo Electron Corporation公司，美國）、超聲波清洗機（DS-060S，深圳市品凰科技有限公司）、游標卡尺（ABS Digimatic（數顯），日本三豐）、電熱恒溫水浴鍋（DKS-16，上海百典儀器設備有限公司）、紫外可見分光光度計（UV-5500，上海元析儀器有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50SⅡ，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、恒溫培養箱（PCD-E3000，蘇州凱特爾儀器設備有限公司）、恒溫培養振蕩器（HNY-211B，河南兄弟儀器設備有限公司）、超凈工作臺（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、5 mL頂空瓶、PDMS 100 μm萃取頭（Supelco公司，美國）、頂空固相微萃取HS-SPME裝置（Supelco公司，美國）、GCMS -QP2010（島津公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 提取液的制備 分別稱取1.00 g巴山榧樹的枝和葉樣品，按1∶20（g∶mL）固液比加入90%乙醇溶液中，150 W 50℃超聲提取3 h，6 000 r/min離心20 min，連續提取3次，將每次的上清液合并，經旋蒸濃縮后用90%甲醇溶液定容至10 mL，制成濃度為0.1 g/mL的提取液，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 抗氧化能力測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率 參考包立軍等［16］的方法測定DPPH自由基清除率。用無水乙醇配制1 mg/L的DPPH溶液，避光保存。預試：在試管中加入2 mL DPPH液，用50 μL量程的移液槍每次精確吸取10 μL提取液加入試管中，當溶液呈無色時的記錄預試加樣量。A0值的測定：取2 mL DPPH溶液，加入1 mL無水乙醇，震蕩1 min使其充分混勻，519 nm測得吸光度即為A0值；A值的測定：取2 mL DPPH溶液，加入提取物的預試加樣量，補加無水乙醇至總體積3 mL，519 nm處測得的吸光值即為A值。試驗設3次平行。

1.2.2.2 ABTS+自由基清除率 參考周晶等［17］的方法略做修改。將7 mmol/L的ABTS+去離子水溶液與2.5 mmol/L的過硫酸鉀按1∶1（V∶V）混合，室溫避光靜置12 h；用無水乙醇稀釋，使吸光度在734 nm處為0.7±0.02。分別取50 μL質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L的提取液，與1.2 mL已稀釋的ABTS陽離子自由基（ABTS+·）溶液反應，6 min后于734 nm處測定樣品吸光值A；以無水乙醇作空白對照。試驗設4次平行。

1.2.2.3 羥基自由基清除率 根據葉穎曉［18］等的試驗方法稍作修改。用去離子水將提取液稀釋成2.0、2.5、5.0、7.5和10.0 g/L待用，取潔凈干燥試管，依次加入4.5×10-3mol/L FeSO4溶液、4.5×10-3mol/L水楊酸-乙醇溶液、待測液與對照溶液各1 mL，最后加6×10-3mol/L H2O22 mL，于37℃水浴中反應0.5 h，在510 nm處測定吸光度。以相同體積去離子水代替樣品溶液作空白對照。

1.2.3 抑菌活性測定 采用牛肉膏瓊脂培養基（牛肉膏3.0 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉5.0 g，去離子水1 000 mL，瓊脂18.0 g。液體培養基則不加瓊脂）活化和擴繁細菌。取適量冷凍保存菌塊，接種于固體培養基上活化，37℃培養24 h，挑取單菌落接種至100 mL液體培養基上，37℃、200 r/min搖床培養15 h制菌液。采用麥氏比濁法，用培養液稀釋菌液至600 nm處吸光值為0.5，制成濃度為107CFU/mL的菌液［19］。

牛津杯法［20］測定提取液的抑菌活性。在超凈工作臺上，將已滅菌的牛肉膏瓊脂培養基倒入直徑9 cm培養皿，吸取上述稀釋后的菌液100 μL，用涂布器涂布均勻，每皿插入2個內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的牛津杯，吸取100 μL的0.1 g/mL提取液轉入牛津杯后用封口膜密封，37℃恒溫培養24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑d（mm）。每處理5次重復，以甲醇為空白對照。

1.2.4 揮發性成分與含量測定 以頂空固相微萃取與氣質聯用法［21］測定巴山榧樹的揮發性成分和與含量。取0.5 g巴山榧枝或葉樣品，加入5 mL裝有磁力攪拌器的頂空瓶中，60℃、PDMS 100 μm萃取頭下萃取30 min，GC解析5 min，GC和質譜條件與楊占南等［21］文中描述一致。將質譜結果和NIST147質譜數據庫進行面積歸一法比對揮發性成分及其相對含量。

1.2.5 數據處理與分析 試驗所得數據用Microsoft office Excel 2016作基本的運算處理及制表，IBM SPSS 23.0軟件包進行方差分析，Duncan法作各水平間的多重比較。圖或表中的所有數據均為平均值±標準差，顯著水平為P＜0.05。采用Origin 9.5作圖。

2 結果

2.1 巴山榧樹枝和葉提取物的抗氧化能力

2.1.1 DPPH自由基清除率 由圖1可見，巴山榧樹枝和葉的提取物對DPPH自由基的清除率顯著不同：枝提取物的清除率顯著高出葉提取物14.3%。此外，開州區的巴山榧樹枝或葉提取物的DPPH自由基清除率均顯著高于巫山縣的，其中枝提取物的清除率高出19.7%，葉提取物的清除率高出8.4%。因此，從清除DPPH自由基的效果看，巴山榧樹的枝提取物優于葉提取物，來自開州區的好于巫山縣的，以開州區的巴山榧樹枝提取物對DPPH自由基的清除率最高，達到39.9%。

圖1 巴山榧樹枝和葉提取物的DPPH自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radical by the extracts of branches and leaves of T. fargesii Franch.

2.1.2 ABTS+自由基清除率 隨著濃度升高，巴山榧樹枝和葉提取物對ABTS+自由基的清除率總體呈上升趨勢（圖2）：當濃度在0.5-1.5 g/L范圍時，ABTS+清除率隨提取物濃度的增加而上升迅速，之后減緩，到達3.0 g/L時，趨于穩定。此外，巴山榧樹枝提取物對ABTS+自由基的清除率顯著高于葉提取物，前者比后者的清除率平均高出10.8%；開州區巴山榧樹枝或葉提取物對ABTS+自由基的清除率顯著高于巫山縣枝或葉提取物清除率的15.2%和11.4%。因此，3.0 g/L巴山榧樹枝或葉提取物是清除ABTS+自由基的適宜濃度。而對ABTS+自由基的清除效果，枝提取物優于葉提取物，開州區的優于巫山的，且開州區巴山榧樹枝提取物的效果最好，在濃度為3.0 g/L時的ABTS+自由基清除率達到95.3%。

圖2 巴山榧樹枝和葉提取物的ABTS+自由基清除率Fig.2 Scavenging rate of ABTS+ free radical in the extracts of branches and leaves of T. fargesii Franch.

2.1.3 羥基自由基清除率 隨濃度增加，巴山榧樹提取物對羥基自由基的清除率呈增加趨勢（圖3）。當濃度為2.0-2.5 g/L時，不同來源和部位巴山榧樹提取物對羥基自由基的清除率無顯著差異；當濃度為10.0 g/L時，巴山榧樹提取物對羥基自由基的清除率因來源和部位不同而差異顯著：葉提取物的清除率顯著高于枝提取物，開州區的顯著高于巫山縣的。在4種類型的提取物中，提取物濃度為10.0 g/L時開州區巴山榧樹葉提取物的羥基自由基清除率最高，達到69.8%，分別比開州區的枝、巫山縣的葉和枝提取物的清除率高出49.6%、16.4%和119%。

圖3 巴山榧樹枝和葉提取物的羥基自由基清除率Fig.3 The scavenging rate of hydroxyl radicals in the extracts of branches and leaves of T. fargesii Franch.

2.2 巴山榧樹枝和葉提取物的抑菌能力

在以甲醇為對照的培養基中，未檢測到抑菌圈；但在加入巴山榧樹枝或葉提取物的培養基中，檢測到有抑菌圈存在，且抑菌圈的直徑因巴山榧樹的來源和部位而差異顯著（圖4）。其中，巴山榧樹枝提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌3種細菌生長的抑制效果均顯著高于巴山榧樹葉提取物，前者比后者的抑菌圈平均直徑分別高出90.7%（大腸桿菌）、90.6%（枯草芽孢桿菌）和32.8%（金黃色葡萄球菌）。此外，巴山榧樹葉提取物對3種細菌生長的抑制效果因來源地不同而差異顯著：開州區比巫山縣的抑菌圈直徑顯著高出24.6%（大腸桿菌）、32.5%（枯草芽孢桿菌）和10.4%（金黃色葡萄球菌），但巴山榧樹枝提取物的抑菌效果在兩地間無顯著差異。不論是巴山榧樹枝還是葉的提取物，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用均顯著高于對金黃色葡萄球菌的抑制作用。因此，巴山榧樹枝或葉的提取物顯著抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌3種細菌的生長和繁殖，且枝提取物比葉提取物，開州區比巫山縣的有更高的抑菌效果。開州區巴山榧樹枝提取物的抑菌效果最高，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達到最大，為26.9 mm。

圖4 巴山榧樹枝和葉提取物的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of branches and leaves extracts of T. fargesii Franch.

2.3 巴山榧樹枝和葉的揮發性成分及其相對含量

在巴山榧樹的枝和葉中共檢測出15種揮發性成分，其中枝含11種，葉含12種，枝和葉中相同的成分有8種（表1）。這些成分可分成3類，即單萜（C10H16）、倍半萜（C15H24）及其加成產物酯類（C12H20O2）［22］，它們的相對含量多少依次為：倍半萜 ＞ 單萜 ＞ 酯類（圖5）。在巴山榧樹枝中僅單萜含量（48.4%）高于葉中含量（44.4%），而倍半萜（50.79%）和酯類含量（0.86%）則低于葉中含量（分別為54.0%和1.60%）。此外，巴山榧樹枝中含有的揮發性化學成分與葉中不同的主要是單萜類，如1，4-二甲基-4-乙烯基-環己烯、β-水芹烯等，含量比葉中高的成分是α-蒎烯、β-月桂烯、α-甜沒藥烯、杜松萜烯等；而葉中含有的單萜、倍半萜和酯類化學成分與枝中的各成分均有不同，如2-亞甲基-6，6-二甲基-［3.1.1］-二環庚烷、2-亞甲基-7，7-二甲基-二環［2.2.1］庚烷、1，7，7-三甲基-二環庚醇乙酸酯、α-蓽澄茄油烯等，含量比枝中高的成分是石竹烯、α-石竹烯、5-亞甲基-1-甲基-8-（1-甲基乙基）-1，6-環癸二烯。

表1 巴山榧樹枝和葉中的揮發性成分及其相對含量Table 1 Volatile components and their relative contents in the branches and leaves of T. fargesii Franch.

圖5 巴山榧樹枝、葉揮發性成分類別及含量Fig.5 Types and contents of volatile chemical constituents from the branches and leaves extracts of T. fargesii Franch.

3 討論

3.1 巴山榧樹枝和葉提取物的抗氧化能力

人和動物體內隨時都進行著氧化還原反應，通過自身的抗氧化系統以及各種抗氧化酶來維持體內的氧化-還原平衡［23］。當氧化與抗氧化系統的平衡失調，便產生氧化應激，使活性氧過度積累而導致組織細胞損傷［24］。為此，在食品的加工、貯藏等生產環節常加入抗氧化劑以加強人體抗氧化機能。其中常用的合成抗氧化劑有三羥基丁基苯酮、叔丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯等［25］。但有研究發現，長期使用合成抗氧化劑會帶來健康隱患（如致癌風險、危害人體臟器等）［26］。由于從植物中提取的天然抗氧化劑具有安全、高效等優點［27］，因此近年來從植物中開發利用天然抗氧化劑逐漸成為研究熱點。目前已從油籽、草藥、香料、蔬菜、水果等植物材料中提取獲得天然抗氧化劑，并在食品的加工、運輸和貯藏等方面得到應用［28］。試驗發現，巴山榧樹的枝和葉提取物都有較好的抗氧化能力，分別能清除30.3%、79.1%、31.9%以上的DPPH、ABTS+和羥基。特別是對ABTS+自由基，清除率可達到96.4%。賈曉會等［6］發現同屬樹種香榧葉的乙醇提取物抗氧化活性較高，對DPPH清除率達94.3%，高于巴山榧樹葉提取物的清除率（32.8%），推測與兩樹種葉的抗氧化活性物質特異性及含量有關。此外，Zhou等［15］用巴山榧樹的假種皮提取物研究的DPPH和羥基自由基清除率的研究發現，0.1 mg/mL的假種皮提取物的DPPH清除率與本試驗的2 mg/L（由試驗值折算）枝提取物接近，0.6 mg/ml的假種皮提取物的羥基清除率與本試驗的10 mg/L葉提取物接近，由于在提取液的制備和試驗方法等存在差異，造成了巴山榧樹假種皮的DPPH和羥基自由基清除率的效果優于枝和葉，綜合來看，巴山榧樹提取物的抗氧化活性存在假種皮＞枝＞葉的關系。但因巴山榧樹的枝、葉更易獲取，較于難以獲取的假種皮資源，巴山榧樹的枝葉開發利用前景或優于假種皮。值得注意的是，本試驗中巴山榧樹葉提取物對羥基自由基的清除率顯著高于枝提取物，與對DPPH和ABTS+的測試結果相反，可能與巴山榧樹枝、葉提取物抗氧化物質的特異性有關，不過這有待進一步證實。總體而言，開州區巴山榧樹的枝葉提取物對3種自由基的清除效果均顯著高于巫山。

天然產物的抗氧化能力與其所含抗氧化劑的種類和含量密切相關［29］，其中酚類和酮類是重要的抗氧化物質［30］。如巴山榧樹的假種皮富含總類黃酮和總多酚，其提取物對DHA藻油有較強的抗氧化效果［15］；香榧的種仁［31］、假種皮［8］和樹葉［6］，以及日本榧樹的樹皮［13］等都含酮類或酚類物質，抗氧化能力較強。王健等［32］研究發現，富含石竹烯、石竹素、4-（2-甲基環己烯）-2-丁烯醛等烯萜成分的紫蘇對DPPH和羥基自由基均有較高的清除效果；Ortegaramirez等［33］發現，富含萜類化合物的植物精油對DPPH和超氧陰離子自由基清除效果極好；此外郭佳等［34］發現富含反式茴香腦、草蒿腦、雙戊烯、γ-松油烯等萜烯化合物的小茴香，對DPPH自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力；Maria［35］對巴西的18種非熱帶堅果的抗氧化研究發現萜類化合物對DPPH和ABTS+自由基有較強清除效果。試驗中檢測到巴山榧樹枝或葉中富含α-蒎烯、5-亞甲基-1-甲基-8-（1-甲基乙基）-1，6-環癸二烯、β-月桂烯和α-甜沒藥烯，且枝和葉中成分和含量明顯不同的是單萜（α-蒎烯、β-月桂烯等）、倍半萜（α-石竹烯、杜松萜烯等）及其加成產物酯類等。結合巴山榧樹枝對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率顯著高于葉，而對羥基自由基的清除率顯著低于葉，推測乙酸異龍腦酯、石竹烯、5-亞甲基-1-甲基-8-（1-甲基乙基）-1，6-環癸二烯等物質有利于清除羥基自由基，而α-蒎烯、α-甜沒藥烯、杜松萜烯等在DPPH和ABTS+自由基的清除上有重要作用，不過該推測還有待進一步證實。

3.2 巴山榧樹枝和葉提取物的抑菌能力

巴山榧樹枝和葉提取物能較好地抑制供試食源性和病原性菌株枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長和繁殖，尤其是對對枯草芽孢桿菌，其抑菌圈直徑達到26.9 mm，這與同屬植物長葉榧［36］和日本榧［12］的葉提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較好的抑制作用效果相似。另有研究表明，1 mg/mL的香榧葉精油對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達21.5 mm［37］。值得注意的是，巴山榧樹的枝對3種被測細菌的抑制能力強于葉，且開州區的抑菌效果優于巫山縣。

巴山榧樹枝和葉的揮發性成分主要為萜烯類物質，其中α-蒎烯含量最高，枝和葉中分別為44.4%和48.4%。因此，α-蒎烯和β-月桂烯等也應是巴山榧樹枝和葉有較強抑菌作用的重要原因，它們通過改變或破壞細胞壁、細胞膜的結構或完整性［38］而產生抑菌作用。同時，枝和葉內其他物質也可能會破壞細菌DNA結構［39］、抑制分生孢子產生［40］、影響細胞代謝（如分解細胞核內線粒體）等［41］途徑產生抑菌作用。

3.3 巴山榧樹枝和葉的揮發性成分

巴山榧樹枝和葉的揮發性成分主要為萜烯類化合物，且以單萜類和倍半萜類化合物為主，分別占98.4、99.14%。萜烯類化合物是合成食用性、藥用化學物質的重要材料，如α-蒎烯常用于合成無毒、高活性、高選擇性的保幼激素類似物［42］，適量的β-石竹烯能對小鼠的神經起保護作用［43］，5-亞甲基-1-甲基-8-（1-甲基乙基）-1，6-環癸二烯對蚊蟲及其幼蟲有較好的誘殺作用［44］等。因此，富含萜烯類成分的巴山榧枝和葉在抗氧化、抑菌、保護神經系統、殺蟲等方面應有較好的開發利用前景。

4 結論

巴山榧樹枝和葉的提取物對DPPH、ABTS+和羥基自由基均有良好的清除效果，且樹枝提取物對DPPH、ABTS+自由基的清除效果顯著高于樹葉提取物，對羥基自由基清除效果則顯著低于樹葉提取物；開州區的巴山榧樹枝和葉提取物對3種自由基的清除能力顯著高于巫山縣。

巴山榧樹枝和葉的提取物對被測細菌具有抑制作用，表現為枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌，且枝顯著大于葉，開州區顯著優于巫山縣。

巴山榧樹枝和葉中共含15種揮發性成分，相同成分有8種，其中98%以上是有抗氧化功能或抑菌活性的單萜和倍半萜。

綜上所述，巴山榧樹枝和葉提取物具有較強的抗氧化能力與抑菌活性，其枝葉揮發性成分主要為單萜和倍半萜。