溶藻弧菌去乙酰化酶基因cobB克隆及其功能驗證

范晨龍 丁燏

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524000）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種嗜鹽且嗜溫型的革蘭氏陰性細菌，可引起魚、蝦、貝等養(yǎng)殖動物鰭間組織潰爛、表皮出血、腎臟發(fā)白、肝胰臟腫大充血等病變。同時，在養(yǎng)殖環(huán)日益惡化的條件下，養(yǎng)殖動物的弧菌病一旦爆發(fā)就會引起養(yǎng)殖動物的大面積死亡［1］。

翻 譯 后 修 飾（post-translational modification，PTM）是一種生物化學(xué)機制，其中蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基被共價修飾。目前，已鑒定出200多種不同類型的PTM［2］，其中研究最多的賴氨酸酰化修飾 是乙酰化。乙酰化可以被蛋白質(zhì)乙酰基轉(zhuǎn)移酶和脫乙酰基酶可逆地催化。賴氨酸的乙酰化首先在組蛋白上鑒定［3］。此后，更多的真核非組蛋白被鑒定為乙酰化，它們參與代謝，細胞周期，衰老，生長，血管生成和癌癥［4-9］。相反，原核生物中的乙酰化研究較少，有限的研究主要集中在少數(shù)微生物物種上。

Sirtuins是NAD dependent依賴性蛋白脫乙酰基酶，廣泛存在于細菌，古細菌和真核生物之中［10］，CobB是一種的細菌Sir2同源物。最初發(fā)現(xiàn)該蛋白與鼠傷寒沙門氏菌LT2中的尿素合成有關(guān)，并部分補償了磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶CobT的失活［11］。隨后的研究表明CobB和酵母Sir2相似具有弱NAD依賴性的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性［12-13］。之后，在其他細菌中發(fā)現(xiàn)了它的同源物，包括大腸桿菌［14］，枯草芽孢桿菌［15］，紅假單胞菌［16］和天藍色鏈霉菌［17］。研究表明這些酶具有強大的NAD依賴性的組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰基酶活性。在腸沙門氏菌中，CobB通過特異性水解Acs活性位點的乙酰賴氨酸中的乙酰基來增強其活性，從而激活了乙酰輔酶A合成酶 （Acs）［18］。在大腸桿菌中，CobB是現(xiàn)今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的脫乙酰基酶［19］，并且CobB的底物參與了多種細胞過程［20］。

本研究以溶藻弧菌為研究對象，首先通過克隆獲得溶藻弧菌的去乙酰化酶cobB基因全序列，對其進行序列特征分析，然后構(gòu)建原核表達載體，并進行蛋白純化及功能驗證，旨在為能更全面的了解cobB基因功能及其調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌HY9901，分離于廣東省湛江港海域患病的紅笛鯛中，由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室保存，大腸桿菌DH5α與BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物公司，原核表達載體pGEX-6p-1由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室保存，EcoRI、Xho I限制性核酸酶、T4DNA連接酶、PrimeSTAR?高保真DNA 聚合酶皆購于大連 TaKaRa 生物有限公司，細菌基因組 DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，寡核苷酸引物合成和DNA 序列測定均由廣州生物工程有限公司完成，GST 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、PreScission Protease購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體Acetylated-Lysine Antibody、Anti-rabbit IgG均購自Cell Signaling Technology，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 將溶藻弧菌HY9901按1∶100比例接種于TSB液體培養(yǎng)基，在28℃、120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)12 h。使用細菌基因組提取試劑盒，提取溶藻弧菌HY9901的基因組。根據(jù)GenBank上溶藻弧菌cobB基因序列（Accession：MT472575），通過Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物，上游引物F：5'-ATGAATTTCCCTTATAGAAATATTG-3'，下游引物R：5'- CTACGCTCTTTCTTTTCCTTCTAGA-3'。以 提取的細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR 程序為：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 5 s，進行 35 個循環(huán)反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物送往廣州生工生物公司進行測序，保證序列正確。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 對獲得的cobB氨基酸序列進行Blast比對分析，利用DNAMAN軟件與胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae；AXA- 20812.1）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila；BBT06705.1）、愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida； QHR94446.1）、大 腸 桿 菌（Escherichia coli；NP_ 415638.3）、腸沙門氏菌（Salmonella enterica；NP_ 460191.1）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae；BAP02949.1）、 魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus；WP_164666070.1）、哈維 弧 菌（Vibrio harveyi；QFQ77439.1）、副 溶 血 性弧 菌（Vibrio parahaemolyticus；WP_140112312.1）進行同源性分析，并利用 MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在線網(wǎng)站分析，氨基酸理化性質(zhì)分析（https://web.expasy.org/protparam/），氨基酸親水性分 析（https://web.expasy.org/protscale/），氨 基 酸跨膜結(jié)構(gòu)域分析（https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），氨基酸信號肽預(yù)測（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/），亞細胞定位預(yù)測（https://www.genscript.com/tools/psort），氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（https://npsa-prabi.ibcp.fr/），氨基酸三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（https://swissmodel.expasy.org/interactive）。

1.2.3 表達載體構(gòu)建 根據(jù)獲得的cobB氨基酸序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，上游引物F：5'-CC GGAATTCATGAATTTCCCTTATAGAAATATTG-3'，下游引物R：5'- CCGCTCGAGCTACGCTCTTTCTTTTC CTTCTAGA-3'，PCR 程序為：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 5 s，進行 35 個循環(huán)反應(yīng)。用EcoR I和Xho I將cobB基因的PCR產(chǎn)物與pGEX-6p-1質(zhì)粒DNA雙酶切后，凝膠電泳后切膠回收，回收得到的基因片段和質(zhì)粒片段按照3∶1摩爾質(zhì)量均勻混合，用T4連接酶16℃過夜連接，構(gòu)建pGEX-6P-1-cobB表達載體，然后將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株，挑選陽性菌落擴大培養(yǎng)后，送往廣州生工生物公司進行測序，保證pGEX-6P-1-cobB載體序列的正確。

1.2.4 融合蛋白的表達及條件優(yōu)化 分別挑取含有pGEX-6P-1-cobB、pGEX-6P-1的單克隆接種于LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，菌液達到OD600=0.5時，以0.5 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)4 h，并設(shè)置未加入IPTG的對照組。為找到CobB蛋白質(zhì)表達的最優(yōu)條件，分別設(shè)置時間梯度（h）：1、2、3、4、5、6和7；IPTG濃度梯度（mmol/L）：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2.0；誘導(dǎo)溫度28℃，37℃并分別破碎后按照全菌上清沉淀的順序進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 融合蛋白的純化及標(biāo)簽的去除 根據(jù)優(yōu)化過的條件對pGEX-6P-1-cobB融合蛋白進行誘導(dǎo)，利用細胞破碎儀進行細菌破碎，上清過GST填料并按照GST 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進行純化，純化所得融合蛋白用PreScission Protease蛋白酶進行GST標(biāo)簽的去除，酶切產(chǎn)物再次過GST填料進行純化，最后進行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 CobB蛋白功能驗證 將純化后去除標(biāo)簽的CobB蛋白與在大腸桿菌中已鑒定為CobB底物的乙酰蛋白GlmU［21］共孵育，驗證CobB蛋白能否將GlmU蛋白去乙酰化。去乙酰化反應(yīng)體系［22-23］如下：50 mmol/L Na2HPO4（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl及500 μmol/L NAD+，5 μmol/L CobB蛋白和5 μmol/L GlmU蛋白，充分混合，反應(yīng)總體積為200 μL。以不加入CobB蛋白或不加入NAD+的反應(yīng)作為陰性對照組。所有反應(yīng)體系均置于25℃孵育6 h。待反應(yīng)完成后，取適量反應(yīng)體系加入等體積SDS-PAGE電泳蛋白質(zhì)上樣緩沖液終止反應(yīng)，使用Western blot法檢測樣品中GlmU蛋白的乙酰化水平。

1.2.7 CobB融合蛋白及去除標(biāo)簽的CobB蛋白功能性比較 將純化后的CobB融合蛋白與純化后去除標(biāo)簽的CobB蛋白，分別與GlmU蛋白共孵育，按上述反應(yīng)體系充分混合。以GST標(biāo)簽蛋白反應(yīng)作為陰性對照組。所有反應(yīng)體系均置于25℃孵育6 h。待反應(yīng)完成后，取適量反應(yīng)體系加入等體積SDS-PAGE電泳蛋白質(zhì)上樣緩沖液終止反應(yīng)，使用Western blot法檢測樣品中GlmU蛋白的乙酰化水平。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆

以溶藻弧菌HY9901基因組為模板，通過PCR克隆全長約750 bp的cobB 基因，結(jié)果如圖1所示，條帶大小正確，將PCR產(chǎn)物送廣州生工生物公司進行測序，測序結(jié)果正確，證明PCR克隆結(jié)果正確。

圖1 cobB基因全長PCR克隆結(jié)果Fig.1 Results of cobB full-length PCR cloning

2.2 生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protpar am/）對CobB蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測，其相 對 分 子 質(zhì) 量 為27.097 5 kD，化 學(xué) 式 為C1186H1865N339O369S10，等電點為5.15。蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，親水性平均系數(shù)（GRAVY）：-0.409，可認(rèn)為CobB為親水性蛋白。TM-HMM 跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，CobB蛋白無跨膜區(qū)域（圖2-A）。SignalP分析結(jié)果顯示S-score最高值為0.456，出現(xiàn)在第一個氨基酸，表明CobB蛋白無信號肽（圖2-B）。亞細胞定位分析表明，CobB蛋白定位于細胞質(zhì)的概率為34.8%，位于線粒體的概率為21.7%，位于核的概率為13%。對CobB蛋白進行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CobB蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成為 α-螺旋占 37.04%，無規(guī)則卷曲占 42.39%，延伸鏈占 12.35%，β-折疊占 8.23%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示它為一個單體，由多個α-螺旋與無規(guī)則卷曲及5個平行β片層所的組成（圖2-C）。

圖2 cobB 序列生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of cobB sequences

本研究將CobB與其他物種中的去乙酰化酶基因進行了比對，通過ClustalW和MEGA 7等生物軟件對CobB和其他物種的去乙酰化酶編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)CobB在弧菌屬同源性很高，都處在90%左右。同源性最低的胸膜肺炎放線桿菌也有72%，說明CobB在革蘭氏陰性細菌中較為保守。

圖3 CobB氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on CobB sequences

為檢測融合蛋白的表達情況，本研究首先進行了pGEX-6P-1與pGEX-6P-1-cobB的誘導(dǎo)實驗，其中融合蛋白分子量約為53 kD，GST蛋白分子量約為26 kD。結(jié)果（圖4）顯示，未加入 IPTG對照組未檢測到GST蛋白或融合蛋白，實驗組pGEX-6P-1在26 kD附近有明顯表達，pGEX-6P-1-cobB在53 kD附近有明顯表達。

圖4 CobB蛋白表達觀測實驗?zāi)z電泳示意圖Fig.4 Schematic diagram of gel electrophoresis of CobB protein expression

為探究融合蛋白表達最適條件，我們分別在不同時間，不同IPTG濃度，不同溫度誘導(dǎo)后，進行SDS-PAGE電泳檢測。時間梯度結(jié)果如圖5所示，在同一濃度誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下，4 h時蛋白表達的程度到達巔峰值。IPTG濃度梯度結(jié)果如圖6所示，IPTG誘導(dǎo)劑濃度在0.4 mmol/L時達到巔峰值，而在2.0 mmol/L時表達量有所下降。溫度梯度結(jié)果如圖7所示，37℃時的全菌中CobB蛋白質(zhì)表達量雖然少于28℃，但37℃時上清表達量卻高于28℃。

圖5 不同誘導(dǎo)時間對 CobB 蛋白表達影響凝膠電泳示意圖Fig.5 Schematic diagram of gel electrophoresis of different induction time on CobB protein expression

圖6 不同IPTG濃度對 CobB 蛋白表達影響凝膠電泳示意圖Fig.6 Schematic diagram of gel electrophoresis of different IPTG concentrations on CobB protein expression

圖7 不同溫度對 CobB 蛋白表達影響凝膠電泳示意圖Fig.7 Schematic diagram of gel electrophoresis of different temperatures on CobB protein expression

2.3 融合蛋白的純化及標(biāo)簽的去除

根據(jù)表達條件優(yōu)化結(jié)果，對融合蛋白進行大量誘導(dǎo)純化，并在純化后進行GST蛋白的切除，結(jié)果如圖8，純化后的融合蛋白在53 kD附近具有單一條帶，蛋白酶切除GST蛋白后的CobB蛋白在27 kD附近具有單一條帶。

圖8 CobB 蛋白純化酶切凝膠電泳示意圖Fig.8 Schematic diagram of digestion gel electrophoresis of CobB protein purification

2.4 CobB蛋白功能驗證

本研究對CobB蛋白功能進行了檢測分析，如圖9所示：在不加入CobB蛋白或不加入NAD+的反應(yīng)中GlmU蛋白的Western blot結(jié)果并無明顯變化，而在加入CobB蛋白與NAD+的反應(yīng)中條帶明顯變淡，說明CobB蛋白將GlmU蛋白的乙酰化程度減弱。

圖9 CobB 去乙酰化 GlmU 蛋白的 Western 印跡Fig.9 Western blot of CobB deacetylated GlmU protein

2.5 CobB融合蛋白及去除標(biāo)簽的CobB蛋白功能 比較

為研究GST標(biāo)簽蛋白是否會對CobB蛋白功能產(chǎn)生影響，我們對CobB融合蛋白及去除標(biāo)簽的CobB蛋白功能進行了檢測分析，如圖10所示：CobB融合蛋白與去除標(biāo)簽的CobB蛋白反應(yīng)中GlmU蛋白的Western blot結(jié)果并無明顯差異，但相較于加入GST標(biāo)簽蛋白反應(yīng)中的條帶明顯變淡，說明GST標(biāo)簽蛋白無去乙酰化活性，且CobB蛋白是否帶有標(biāo)簽對其本身去乙酰化活性并無影響。

圖10 CobB融合蛋白及去除標(biāo)簽的CobB蛋白去乙酰化GlmU蛋白的Western 印跡Fig.10 Western blot of CobB fusion protein and CobB protein deacetylated GlmU protein

3 討論

去乙酰化酶普遍存在于動植物和微生物體內(nèi)，去乙酰化酶CobB對細胞分裂、染色體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及新陳代謝的調(diào)節(jié)等［24-28］生命過程具有重要意義。盡管其主要作用似乎在于代謝過程，但賴氨酸乙酰化也與調(diào)節(jié)細菌的發(fā)病機理有關(guān)［29］。本研究從溶藻弧菌中克隆了一種去乙酰化酶基因cobB，其相對分子質(zhì)量為 27.097 5 kD；等電點為5.15，CobB蛋白為無跨膜結(jié)構(gòu)域無信號肽的親水性蛋白，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其為一個單體，由多個α-螺旋與無規(guī)則卷曲及5個平行β片層所的組成；亞細胞定位結(jié)果表明其定位于整個細胞中。說明CobB為分泌蛋白并廣泛分布于細胞之中，從側(cè)面驗證了CobB的底物參與多種細胞過程。進化樹分析表明，CobB與同屬于弧菌屬的魔鬼弧菌、哈維弧菌、霍亂弧菌及副溶血性弧菌的同源性較高，同胸膜肺炎放線桿菌、嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、大腸桿菌及腸沙門氏菌等革蘭氏陰性菌親緣性較近；說明該蛋白在革蘭氏陰性菌的進化歷程中比較穩(wěn)定。

蛋白誘導(dǎo)、純化及 Western Blot 分析表明融合蛋白正確翻譯表達，重組蛋白的表達量與時間、IPTG濃度、溫度等誘導(dǎo)條件有關(guān)。融合蛋白在4 h條件下誘導(dǎo)表達量上升到最高，增加誘導(dǎo)時間，蛋白表達量并無明顯變化，表明誘導(dǎo)時間增長并不會再增加目的蛋白的積累。融合蛋白在0.4 mmol/L-1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，表達量處于較高水平；由于IPTG本身具有毒性，高濃度IPTG條件下反而會導(dǎo)致細菌生長緩慢，在2.0 mmol/L IPTG條件誘導(dǎo)下，蛋白表達量有所下降；融合蛋白在37℃時表達量低于28℃，但上清中37℃時表達量高于28℃，說明CobB融合蛋白在37℃時具有較高的上清表達，由于包涵體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不利于后續(xù)的處理與研究。在為蛋白表達選擇最優(yōu)溫度條件時應(yīng)選擇上清表達量較多的37℃。因此誘導(dǎo)CobB融合蛋白的適宜條件為37℃ 0.4 mmol/LIPTG濃度下誘導(dǎo)4 h。功能性分析表明CobB可去除乙酰化蛋白的乙酰化程度，GST標(biāo)簽蛋白的存在并不影響CobB的去乙酰化酶活性。綜上，CobB在細菌中具有重要的功能和調(diào)控作用，本研究結(jié)果為下一步在細菌體內(nèi)研究該基因的相關(guān)機理作用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了溶藻弧菌的cobB基因，構(gòu)建了CobB表達菌株，確定了其最優(yōu)表達條件為結(jié)果為37℃，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h；并驗證了CobB的去乙酰化功能。