化學分子伴侶及誘導條件協同強化Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達

段緒果 張玉華 黃婷婷 丁乾 欒舒越 朱秋雨

（南京林業大學輕工與食品學院，南京 210037）

α-葡聚糖磷酸化酶（EC 2.4.1.1）廣泛存在動物、植物和微生物中，能夠催化α-1，4-葡聚糖的可逆性磷酸解反應，該酶屬于糖基轉移酶35家族［1-2］。不同來源的α-葡聚糖磷酸化酶催化機制非常相似，幾乎都需要5-磷酸吡多醛作為輔因子，以及一段短寡糖鏈作引物。α-葡聚糖磷酸化酶構成了一個具有高度同源性的大家族，包括：糖原磷酸化酶、淀粉磷酸化酶和麥芽糊精磷酸化酶。這些酶的調節機制及底物特異性均有所不同。如來源于兔肌肉及土豆中的α-葡聚糖磷酸化酶分別為典型的調節與非調節的酶，前者受到別構效應調節，而后者不受別構效應調節［3］。

α-葡聚糖磷酸化酶可用于制備葡萄糖-1-磷酸［4］、直鏈淀粉［5-6］及pH敏感水凝膠［7］等高附加值產物［8］。其中，葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G-1-P）是糖代謝中重要的中間產物，具有重要的藥用價值，可作為制備細胞增殖抑制劑和抗生素等產品的原料。α-葡聚糖磷酸化酶能夠以廉價的淀粉質、糊精等原料為底物，通過催化可逆性磷酸解反應，催化形成葡萄糖-1-磷酸。國外對利用葡聚糖磷酸化酶催化淀粉底物制備葡萄糖-1-磷酸的研究較早，1994年Andreas等將重組麥芽糊精磷酸化酶固定在超濾反應器上，以麥芽糊精為底物連續生產葡萄糖-1-磷酸，在30℃，pH 7.5條件下，產率達2.6 g/L/h。但是麥芽糊精磷酸化酶為常溫酶，熱穩定性差，不能滿足工業需求，所以高溫磷酸化酶逐漸受到重視［9］。近年來隨著嗜熱微生物來源高溫α-葡聚糖磷酸化酶的開發，國內外對該酶的研究逐漸增多［10］。2005年，Bae等［4］對Thermus caldophilus α-葡聚糖磷酸化酶進行分離純化，在70℃條件下以可溶性淀粉為原料制備葡萄糖-1-磷酸，產率達69.78%。2016年Zhou等［11］采用Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶與異淀粉酶等復配轉化淀粉，葡萄糖-1-磷酸最高產量可以達到52 g/L。2016年，張堯等［12］利用重組Pyrococcus furiosus α-葡聚糖磷酸化酶轉化普通玉米淀粉來制備葡萄糖-1-磷酸，轉化率達到65.1%。雖然酶法合成葡萄糖-1-磷酸取得一定的進展，但仍存在一些不足，如α-葡聚糖磷酸化酶產量較低，使用成本較高等問題。

由于直接利用嗜熱微生物發酵制備α-葡聚糖磷酸化酶存在產量低、發酵條件苛刻、成本高等問題。異源重組表達是獲得高溫α-葡聚糖磷酸化酶的主要方式，其中大腸桿菌表達系統的應用最為普遍。盡管大量外源蛋白已經成功實現了在大腸桿菌表達系統中過量表達，但是多數蛋白異源表達過程中非常容易形成無活性的包涵體，導致可溶性表達水平偏低，這是限制大腸桿菌表達系統廣泛應用的主要瓶頸之一。目前，有多種途徑被用來提高異源蛋白的表達水平，如培養條件優化、融合表達、共表達分子伴侶、添加滲透壓調節劑（化學分子伴侶） 等［13-14］。其中，共表達分子伴侶或添加化學分子伴侶均可以在細胞內部穩定蛋白折疊構象、促進蛋白正確折疊，從而減少蛋白聚集及包涵體形成，提高可溶性蛋白所占的比例［15］。由于不同蛋白組成及結構不同，導致蛋白折疊中間體以及折疊和聚集動力學存在顯著差異，而且影響蛋白質折疊和聚集的機制極其復雜，因此很難預測哪種分子伴侶、化學分子伴侶對特定蛋白的折疊具有促進作用。研究發現，采用實驗優化的方法來篩選對特定蛋白具有促進作用的因素，是一種行之有效的方法。

本研究構建了產T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌株，為進一步提高重組酶可溶性表達水平，分別從誘導條件（誘導劑種類、誘導劑濃度、溫度、誘導劑添加時間）和分子伴侶（共表達分子伴侶、化學分子伴侶種類及濃度）兩個方面對重組酶可溶性表達的影響進行了考察，以期為α-葡聚糖磷酸化酶的高效制備和應用提供的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 pET24a（+）、E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）、分別含有1種分子伴侶質粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的 宿 主細胞E. coli BL21（DE3）為本實驗室保藏。海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶編碼基因α-GPtm為上海生工生物工程有限公司合成，該基因根據大腸桿菌密碼子偏好性進行了優化，基因片段兩端酶切位點分別為NdeⅠ和Hind Ⅲ，該基因被連接在克隆載體pUC57中，命名為pUC57-α-GPtm。

1.1.2 試劑 限制性內切酶Nde I、Hind III、T4 DNA連接酶和CIAP等購自大連寶生物工程公司。質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素購自上海生工生物工程公司。UTP（尿苷三磷酸），PPase（無機焦磷酸化酶）和UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）購自Sigma-Aldrich公司。蛋白胨和酵母粉購自Oxoid公司。其它試劑均為國產分析純，購自國藥集團。

1.1.3 培養基 LB培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，121℃滅菌30 min，使用前加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素或者30 μg/mL的卡那霉素。固體LB培養基在此基礎上添加1.5%（W/V）瓊脂粉。

TB培養基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31，甘油5，用1 mol/L NaOH調pH至7.0-7.2，121℃滅 菌30 min，使用前加入終濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建及轉化子篩選 將帶有目的基因的克隆載體pUC57-α-GPtm經過Nde I和Hind Ⅲ酶切，并與經過相同酶切并去磷酸化的表達載體pET24a（+）連接，連接產物轉化E. coli JM109，涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上，培養過夜篩選轉化子。挑取轉化子至含有30 μg/mL卡那霉素的液體LB培養基中，培養后提取質粒。經酶切驗證且測序正確的質粒pET24a-α-GPtm直接轉化表達宿主E. coli BL21（DE3），涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上進行篩選。挑取陽性轉化子接入LB培養基中培養過夜，并保存甘油管備用。

1.2.2 分子伴侶共表達系統的構建 分別將含有1種分子伴侶質粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pGTf2和pTf16的E. coli BL21（DE3）宿主細胞進行培養，采用標準流程制備感受態細胞。將表達載體pET24a-α-GPtm分別轉化感受態細胞，得到帶有不同類型分子伴侶質粒的共表達菌株。

1.2.3 重組菌的搖瓶發酵 種子培養：從-80℃ 保藏的甘油管中取20 μL菌液，接種于含有Kan抗性的10 mL LB培養基中，37℃、200 r/min，培養8 h。

搖瓶發酵：以5%（V/V）接種量將活化的菌體轉接至裝液量為50 mL TB培養基的250 mL三角瓶中。37℃、200 r/min，培養4 h，加入0.8 mmol/L IPTG誘導，繼續培養至20 h。

發酵條件優化：分別對誘導劑種類、誘導劑濃度、溫度、誘導劑添加時間、化學分子伴侶種類及濃度和共表達分子伴侶等因素進行優化。共表達分子伴侶的重組菌株發酵方法參考TaKaRa公司分子伴侶質粒系統使用說明。

樣品制備：將搖瓶發酵所得菌液，于4℃ 離心收集菌體、8 000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體；用0.02 mol/L磷酸緩沖溶液進行充分懸浮，在4℃ 下進行超聲細胞破碎儀處理細胞，處理方式是：200 W，工作3 s，間歇5 s，共處理10 min。在此過程中，菌液始終置于冰水混合浴中。將細胞破碎液于4℃、8 000 r/min離心10 min除去細胞碎片沉淀，上清為含有α-葡聚糖磷酸化酶的粗酶液。

1.2.4 菌體生物量的測定 發酵液濁度（OD600）測定：以去離子水為空白對照，將發酵好的菌液稀釋適當倍數后，用UVmini-1240紫外分光光度計測定其于600 nm處的吸光值A600。稀釋倍數以在0.2-0.8之間為宜，則OD600=A600×稀釋倍數。

細胞干重測定：取一定量發酵液于12 000 r/min下離心5 min，用生理鹽水洗滌兩次，離心后菌泥于105℃烘至恒重后稱重。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 根據α-葡聚糖磷酸化酶的分子量，分離膠選用12% SDS-PAGE（＞10 kD）的電泳方案。電泳凝膠配方，電泳參數及凝膠的染色、脫色方法均參照標準實驗方法進行。

1.2.6 α-葡聚糖磷酸化酶活力的測定 酶活力測定方法參考張堯等［12］并根據所用酶的特點進行調整。反應總體積為1.0 mL，該體系含有50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.2），2 mmol/L MgCl2，1%可溶性淀粉，2 mmol/L UTP，5 U/mL PPase及3 U/mL UGPase，以包含除酶外所有底物的體系作為對照，70℃反應10 min，加入次氯酸終止反應，再用氫氧化鉀調節pH至7.0。12 000×g，4℃離心10 min 除去變性酶蛋白，上清液進行HPLC 分析。HPLC 條件為，Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長260 nm，流動相為50 mmol/L 甲酸銨（pH3.5），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。

酶活定義：在上述反應條件下，每分鐘形成1 μmol 葡萄糖-1-磷酸所需的酶量定義為1個酶活力單位。

2 結果

2.1 重組菌株的構建及驗證

首先，將含有目的基因的克隆載體pUC57-α-GPtm進行雙酶切、膠回收并純化得到2.4 kb左右的目的基因片段。將該基因片段與同樣酶切純化回收的表達載體pET24a（+）連接后轉化E. coli JM109，挑選陽性克隆，轉接LB培養基，培養后再提取質粒。重組質粒經Nde I和Hind Ⅲ雙酶切，核酸電泳檢測結果顯示得到兩條大小分別為5.3 kb和2.4 kb的條帶，結果與預期相符，證明α-GPtm基因已成功連接到表達載體中。將重組質粒轉化表達宿主E. coli BL21（DE3），得到重組菌株E. coli BL21（DE3）/ pET24-α-GPtm。

重組菌株在37℃條件下進行培養并經過0.8 mmol/L IPTG誘導，培養24 h取樣測定酶活力，酶活力為5.2 U/mL。利用12% SDS-PAGE對重組菌的發酵上清和全細胞進行蛋白電泳檢測，在發酵液和細胞中都有與目的重組蛋白理論分子量相一致的條帶，條帶大小約為90 kD（圖1），而還有空載體的對照菌株樣品沒有相應條帶出現。酶活力測定及蛋白電泳結果都表明重組α-葡聚糖磷酸化酶成功實現了表達。SDS-PAGE蛋白分析發現，重組蛋白可溶性表達水平偏低，存在較多包涵體。

圖1 重組菌株及對照菌株發酵產α-葡聚糖磷酸化酶SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of α-glucan phosphorylase produced by the recombinant strains and the control strain

2.2 誘導劑濃度對重組菌生長及產酶的影響

誘導劑對重組蛋白的表達水平及狀態具有重要的影響，因此非常有必要對誘導劑的種類及濃度進行考察及優化。本研究中所用表達載體為pET24a（+），該載體的啟動子是T7啟動子。T7啟動子處于LacI阻遏蛋白的調控下，當添加誘導劑進行誘導時，阻遏蛋白與誘導劑結合并發生構象改變，從操縱基因上脫離并激活T7 RNA聚合酶的轉錄、表達，最終激活T7啟動子控制下的目的基因的表達。T7啟動子常用的誘導劑是乳糖和IPTG。本研究分別對不同濃度的乳糖和IPTG對重組菌生長及產酶的影響進行了考察。

2.2.1 乳糖濃度對重組菌生長及產酶的影響 由圖2可知，當以乳糖為誘導劑時，不同濃度的乳糖對菌體生長和α-葡聚糖磷酸化酶產量的影響不同。當乳糖濃度為0 g/L、5 g/L和10 g/L時，菌體濃度沒有明顯變化，發酵液細胞干重都在4.0 g/L左右；當乳糖濃度超過10 g/L時，繼續提高乳糖濃度，菌濃開始下降，當乳糖濃度為20 g/L時，細胞干重只有3.5 g/L。乳糖對α-葡聚糖磷酸化酶的產量也有明顯影響，不加乳糖誘導劑時，酶活力只有1.4 U/mL，當乳糖濃度為5 g/L時，酶活力最高，為12.0 U/mL；繼續提高乳糖濃度，酶活力開始降低。

圖2 乳糖濃度對重組菌生長、產酶的影響（A）和細胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 2 Effect of lactose concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.2.2 IPTG濃度對重組菌生長及產酶的影響 由圖3可知，當以IPTG為誘導劑時，當IPTG濃度低于0.05 mmol/L時，對菌體生長沒有影響；當IPTG濃度高于0.05 mmol/L時，隨著IPTG濃度的升高，菌體濃度逐漸降低；當IPTG濃度為0.4 mmol/L時，發酵液細胞干重為3.5 g/L，只有IPTG為0.05 mmol/L時菌體濃度的85%。上述結果顯示高濃度的IPTG會抑制細胞的生長，原因是IPTG對重組細胞具有一定的毒性。當IPTG濃度在0 mmol/L和0.2 mmol/L之間時，隨著誘導劑濃度的提高，重組α-葡聚糖磷酸化酶逐漸提高，最高酶活力15.1 U/mL是不加誘導劑時酶活力的12.6倍。當IPTG濃度高于0.2 mmol/L時，重組α-葡聚糖磷酸化酶明顯下降；當濃度達到0.4 mmol/L時，酶活力只有11.2 U/mL。這種現象與Jhamb等在報道的結果類似，Jhamb等發現木聚糖酶在大腸桿菌中重組表達時，IPTG濃度對重組蛋白的可溶性具有重要的影響，當IPTG濃度過高時重組木聚糖酶主要以包涵體形式存在，可溶性酶比例 降低［14］。

圖3 IPTG濃度對重組菌生長、產酶的影響（A）和細胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 3 Effect of IPTG concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

根據誘導劑（乳糖和IPTG）優化結果可以看出，以IPTG為誘導劑時，重組α-葡聚糖磷酸化酶最高活力是以乳糖為誘導劑時最高酶活力的1.3倍，因此本研究后續實驗采用IPTG為誘導劑。

2.3 誘導溫度對重組菌生長及產酶的影響

誘導溫度是影響重組蛋白表達的另一個重要因素，在發酵過程中應嚴格地控制該參數，以獲得最佳生產效率。一般來說，誘導溫度高，表達強度大，重組蛋白較易形成包涵體；而低誘導溫度可以降低表達速度，減少包涵體的形成并提高可溶性重組蛋白的比例。本研究首先將重組菌在37℃培養4 h，然后分別25、28、30、33和37℃條件下加入誘導劑對重組菌進行誘導培養，并對重組菌生長及產酶情況進行分析。如圖4所示，隨著培養溫度的升高，菌體濃度和酶活力變化趨勢一致，都是先升高再降低。當誘導溫度為28℃時，發酵液中細胞干重和酶活力分別為4.3 g/L和22.8 U/mL。繼續提高誘導溫度，菌濃緩慢降低，而酶活力快速下降。當誘導溫度為37℃時，重組α-葡聚糖磷酸化酶活力只有9.5 U/mL，是28℃時酶活力的41.7%。在對2種融合蛋白VP1-GFP和VP1-LAC的重組表達過程中發現低溫可以明顯的提高重組蛋白的質量；而高溫培養時，重組蛋白折疊效率降低，更容易形成蛋白聚集體。為了提高重組酶的可溶性表達水平，本研究后續實驗采用28℃作為重組菌株的誘導培養溫度。

圖4 誘導溫度對重組菌生長、產酶的影響（A）和細胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 4 Effect of induction temperature on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.4 誘導劑添加時間對重組菌生長及產酶的影響

根據2.2節中研究結果可知，本研究選用IPTG作為最佳誘導劑，除誘導劑濃度對重組蛋白表達具有重要影響外，誘導劑添加時間是另外一個重要參數。本研究選擇接種后0 h、2 h、4 h、6 h和10 h，分別添加0.2 mmol/L IPTG進行重組酶的誘導表達。如圖5所示，誘導劑添加時間對重組菌株的生長和產酶都具有非常明顯的影響。過早添加誘導劑（0 h和2 h）時，菌體生長和產酶都會受到明顯抑制，0 h添加誘導劑，發酵液細胞干重和酶活力分別為1.1 g/L和6.1 U/mL。隨著誘導劑添加時間的增加，菌濃和酶活力都逐漸增加。當誘導劑添加時間為6 h時，發酵液細胞干重和酶活力分別為4.1 g/L和27.0 U/mL，分別是0 h添加誘導劑時相關參數的3.9倍和4.4倍。繼續增加誘導劑添加時間，菌濃略有增加，但是酶活力顯著降低。當誘導劑添加時間為10 h時，酶活力為16.0 U/mL，是最佳條件下酶活力的59.2%。

圖5 誘導劑添加時間對重組菌生長、產酶的影響（A）和細胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 5 Effect of adding inducer at different times on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.5 共表達分子伴侶對產酶的影響

對帶有重組載體pET24a-α-GPtm和不同分子伴侶 質 粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的共表達重組菌分別進行搖瓶發酵和誘導表達，結果顯示5種分子伴侶共表達對α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表達水平均沒有提高，因此后續研究以沒有共表達分子伴侶的菌株為研究對象。

2.6 添加化學分子伴侶對重組菌生長及產酶的 影響

從2.2、2.3和2.4的結果可以看出，較低的誘導溫度、適合的誘導強度及誘導時間對重組α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達水平具有明顯的促進作用。此外，研究發現仍然有一定比例的重組α-葡聚糖磷酸化酶會以包涵體的形式存在，如果能夠減少包涵體的形成，有望進一步提高α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表達水平。細胞內部天然存在的一些小分子滲透壓調節劑不但能夠顯著地提高一些蛋白的熱穩定性，而且可以促進蛋白的正確折疊。這些小分子滲透壓調節劑由于具有提高天然蛋白的熱穩定性和促進非折疊多肽復性的獨特作用，而被稱為“化學分子伴侶”。本研究根據文獻報道，選擇了8種試劑（苯乙醇、甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇），考察它們對菌體生長及α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達的影響。

如圖6-A所示，添加10 mmol/L不同化學分子伴侶對菌體生長及α-葡聚糖磷酸化酶表達具有不同地影響。其中，苯乙醇對重組菌生長及產酶都有明顯的抑制作用；甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸對菌體生長有一定的促進作用；氧化三甲胺和肌醇對菌體生長影響不明顯。在酶活力方面，苯乙醇、甘氨酸和海藻糖對酶活力有不同程度的抑制作用，其中海藻糖和苯乙醇抑制作用最為明顯，酶活力只有對照組的28.0%和43.6%。苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇對重組酶產量有不同程度的促進作用，其中氧化三甲胺和肌醇促進效果最佳，酶活力分別是對照酶活力的1.6倍和2.0倍。進一步研究發現，同時添加氧化三甲胺和肌醇，對重組酶的產量沒有協同促進作用。

進一步考察了不同濃度肌醇（0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L和40 mmol/L）對重組菌發酵的影響。如圖6-B所示，不同濃度肌醇對重組菌生長沒有明顯影響，但是對酶活力具有顯著的影響。在0 mmol/L到20 mmol/L范圍內，隨著肌醇濃度的提高，酶活力逐漸提高，最高酶活力為58.8 U/mL，是不加肌醇時酶活力的2.6倍。當肌醇濃度大于20 mmol/L時，酶活力逐漸降低；肌醇濃度為30 mmol/L和40 mmol/L時，酶活力分別為57.8 U/mL和47.9 U/mL。因此最佳化學分子伴侶為肌醇，最佳濃度為20 mmol/L。

圖6 化學分子伴侶種類（A）及肌醇濃度（B）對重組菌生長、產酶的影響Fig. 6 Effect of different chemical chaperone (A) and inositol concentration (B) on the recombinant strain growth and enzyme production

2.7 最優發酵條件下重組菌株生長及產酶曲線

在最佳培養及誘導條件下，將發酵時間延長到40 h，中間每隔一定時間取樣測定重組菌株的發酵液細胞干重和重組酶活力，并繪制相應菌體生長和產酶曲線。如圖7 所示，0-2 h為重組菌株生長延滯期；2-12 h為重組菌株對數生長期；重組菌株發酵25-30 h為生長穩定期；發酵30 h 以后進入衰亡期。酶活力增長趨勢與菌體生長總體一致并略有滯后，酶活力在30 h 達到最高，為62.0 U/mL。

圖7 重組菌在最佳條件下生長曲線和產酶曲線Fig. 7 Growth curve and enzyme production curve of recombinant strain on the optimal condition

3 討論

α-葡聚糖磷酸化酶在葡萄糖-1-磷酸、合成直鏈淀粉及pH敏感水凝膠等高附加值產品的制備中具有廣泛的應用價值。近年來國內外對該酶基因克隆表達、定性及應用評價等方面的報道逐年增 多［7，11-12］。但是，關于如何實現α-葡聚糖磷酸化酶高效發酵制備方面研究，國內外卻鮮有報道。

研究發現，重組酶表達過程中，誘導條件[16-18]、除基因轉錄、翻譯等會影響其表達量以外，不同類型酶自身特性（氨基酸組成、分子量大小、空間結構等）、宿主菌、培養表達條件等方面的差異亦會顯著影響重組酶的折疊狀態等，最終導致不同酶表現出在產量、可溶性比例等方面的巨大差異［19-21］。因此，重組菌株的構建只是獲得重組酶的第一步。然而蛋白難以可溶性表達的情況時有發生，目前除了可以采用融合促溶標簽［22-25］、蛋白質工程改造［26］、定向進化［27-28］等不同的策略來促進蛋白的正確折疊以提高其可溶表達水平以外，篩選與之匹配的培養表達條件也是促進蛋白可溶性表達的重要手段之 一［29-30］。本研究在構建產海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌后，首先采用常規培養條件（培養溫度為37℃，誘導劑濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導）進行誘導培養，酶活力檢測結果顯示酶活力僅為5.2 U/mL，SDS-PAGE蛋白電泳顯示有較多的重組酶為不可溶的包涵體，說明該重組酶可溶性表達水平較低。為提高重組酶的可溶性表達水平，分別對誘導劑種類、誘導劑濃度、溫度、誘導劑添加時間、共表達分子伴侶、添加化學分子伴侶等因素進行了優化。通過降低誘導強度（0.2 mmol/L IPTG）、誘導階段低溫培養（28℃），以及添加化學分子伴侶（20 mmol/L的肌醇），重組α-葡聚糖磷酸化酶的表達水平由5.2 U/mL提高到62.0 U/mL，可溶性酶的活力提高了11.9倍。該策略無需融合促溶標簽，因此后續不用切割去除融合標簽，下游處理工藝更加簡單方便；此外，本方法亦無需對目的蛋白進行分子改造，因此可以最大限度的保持重組酶的天然結構，不會對酶的功能產生影響。該工藝的建立，顯著提高了重組菌株發酵制備α-葡聚糖磷酸化酶的活力水平，為α-葡聚糖磷酸化酶進一步發酵放大奠定了基礎，也可為其它蛋白的可溶性重組表達制備提供參考。

4 結論

本研究構建了產海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌株，搖瓶培養發現該酶主要以包涵體形式存在，可溶性表達水平偏低。為減少包涵體的形成，提高重組酶可溶性表達水平，分別對誘導劑種類、誘導劑濃度、溫度、誘導劑添加時間、分子伴侶、化學分子伴侶種類及濃度等因素對重組酶表達的影響進行了考察。優化后的最佳培養條件為：接種重組菌株的同時，向TB發酵培養基中添加終濃度為20 mmol/L的肌醇；然后在37℃條件下培養6 h，降溫至28℃并加入0.2 mmol/L IPTG，繼續誘導培養。發酵30 h 酶活力達到最高，為62.0 U/mL，是優化前酶活力的11.9倍。