馬齒莧粗多糖除蛋白方法的篩選及優化

◎ 楊星星，楊錦穎，董慶軍，徐海洋，曲曉蘭,2

（1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東 泰安 271016;2.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥理學研究所，山東 泰安 271016）

馬齒莧在我國是一種極為常見的野菜，南北方各地均有分布，它不僅營養豐富而且具有較高的經濟價值，在食品、化工、藥品、農牧業等諸多領域具有廣泛的開發前景。馬齒莧多糖是其主要活性成分之一，具有抗病毒、提高免疫力、抗衰老、降糖調脂等活性[1-2]。在其制備工藝中，去除蛋白為提高馬齒莧粗多糖純度和品質的重要環節[3-4]。因此，本研究以除蛋白率和多糖損失率為指標，選取4種常用的除蛋白方法Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、酶法和鹽酸法進行比較研究[5-6]，旨在得到一種馬齒莧多糖除蛋白效率高、多糖損失低且綠色安全的方法，以期為馬齒莧多糖產業化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

KQ500-VDE超聲波清洗器（昆山測試儀器有限公司）；UV-2700型分光光度計（日本Shimadzu）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；STARTER-2100型pH計（奧豪斯儀器公司）等。

馬齒莧采自山東第一醫科大學藥用植物園，考馬斯亮藍試劑盒（南京建成生物工程研究所），木瓜蛋白酶（Solarbio），三氯乙酸、葡萄糖、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、氯仿、正丁醇等均為國產AR。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧粗多糖的提取

馬齒莧全草干燥粗粉50.00 g→石油醚回流脫 脂→500 mL純凈水超聲提取（2次，30 min/次）→抽 濾→濾液濃縮→0.1%活性炭脫色→加4倍量95%乙醇→低溫冷藏靜置12 h→抽濾→濾渣分別用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌→所得沉淀除乙醇→55 ℃干燥→得馬齒莧粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定

配制馬齒莧粗多糖水溶液（0.1 mg·mL-1），選擇苯 酚-硫酸法[7]利用葡萄糖溶液做回歸曲線，測定待測樣品的A490nm，橫坐標C（mg·mL-1）為葡萄糖標準品，縱坐標為A（nm）為樣品吸光度，做回歸方程A=0.076 2C+1.680 1（R=0.999 4）并按照式（1）計算多糖含量，多糖損失率計算如式（2）。

式中：A0-除蛋白前樣品中多糖質量；A1-為除蛋白樣品中多糖含量。

1.2.3 蛋白質含量測定

配制50 mg·mL-1的樣品溶液，參照考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒說明書中介紹的方法，測定樣品的A595nm，并依據公式（3）計算出樣品的蛋白濃度，除蛋白率計算如式（4）：

式 中：OD0-空 白OD值；OD1-測 定OD值；OD2-標準OD值；C1-標準品濃度（0.5 mg·mL-1）

式中：C0-除蛋白前樣品中蛋白濃度；C1-除蛋白后樣品中蛋白濃度。

1.2.4 除蛋白方法的篩選

（1）Sevage法。取馬齒莧粗多糖水溶液（10 mg·mL-1） 50 mL，按5∶1（體積比）加Sevage試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4），劇烈振搖后靜置，離心，將兩液面交界處變性蛋白去除。吸取上層溶液重復上述操作數次直至無沉淀物后進行測定。

（2）三氯乙酸（TCA）法。取馬齒莧粗多糖水溶液 （10 mg·mL-1）50 mL，用10%三氯乙酸調節pH=3，振搖均勻，低溫冷藏過夜，離心后，取上清液進行測定。

（3）酶法。取馬齒莧粗多糖水溶液（10 mg·mL-1）50 mL，調節pH=6后加入木瓜蛋白酶至濃度1.0%，置于50 ℃水浴中2 h（酶解），而后換成沸水浴中加熱10 min（酶滅活），取出放置至室溫后，離心，取上清液進行測定。

（4）鹽酸法。取馬齒莧粗多糖水溶液（10 mg · mL-1）50 mL，加入鹽酸（1 moL·L-1）調節pH=3，持續振蕩，混勻后靜置，離心，取上清液進行測定。

（5）酶法除蛋白單因素試驗。取馬齒莧粗多糖水溶液（10 mg·mL-1）50 mL，使用鹽酸調節適宜pH，加入木瓜蛋白酶至一定濃度，在特定的溫度條件下，進行水浴規定時間，而后置于沸水浴中加熱10 min（酶滅活），取出放置至室溫后，離心，取上清液進行測定。單因素試驗條件分別為：酶用量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（溫度為50 ℃，pH=6，時間2 h）；酶解時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h（溫度為50 ℃，pH=6，木瓜蛋白酶用量1.0%）；酶解溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃（木瓜蛋白酶用量1.0%，pH=6，時間2 h）；酶解pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0（木瓜蛋白酶用量1.0%，時間2 h，溫度為50 ℃）。

2 結果與分析

2.1 除蛋白方法比較結果

以多糖損失率和除蛋白率為評價指標，對比4種方法的除蛋白效果，結果表明（圖1）應用最為廣泛的Sevage法除蛋白效果高于其他3種方法，但此法的多糖損失率也較高；三氯乙酸法的除蛋白率低于Sevage法和酶法，多糖損失率低于Sevage法，高于酶法；鹽酸法除蛋白率最低，多糖損失率最高。Sevage法和三氯乙酸法中存在有毒有機溶劑殘留，雖然除蛋白率都較高，但相對安全性較差；酶法清除蛋白效果相對較好，且方法綠色安全，故選擇酶法開展單因素試驗，以提高除蛋白率，降低多糖損失率。

圖1 4種除蛋白方法的比較圖

2.2 酶法除蛋白單因素試驗

2.2.1 酶用量對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響由圖2可知，多糖損失率與酶用量無明顯相關性。在木瓜蛋白酶的用量小于1.5%時，除蛋白的效率是隨著酶用量的增加而增加的，而后除蛋白質率基本趨于平穩。說明木瓜蛋白酶可以降解馬齒莧多糖中的蛋白質，達到除蛋白的效果，考慮到工藝成本及木瓜蛋白酶用量增加可能會對多糖成分有影響，故選擇木瓜蛋白酶用量為1.5%。

圖2 酶用量對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響圖

2.2.2 酶解時間對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

由圖3可知，酶解時間小于2.5 h時，除蛋白質效果和蛋白損失率均跟隨著酶解時間的增加而呈現上升，除蛋白率在2.5 h時達到最高，之后隨著時間增加，除蛋白率變化不大，蛋白損失率則仍然呈現上升。可能是因為隨著酶解時間的增加，使酶與蛋白充分作用，但當酶已經反應充分后，除蛋白的效果受反應時間延長影響不大，但蛋白損失率會持續增加。因此，酶解時間應控制在2.5 h左右。

圖3 酶解時間對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

2.2.3 酶解溫度對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

由圖4可知，40～55 ℃區間內，除蛋白率隨著溫度上升而增加，在55 ℃時清除率達到最大，之后呈現較為明顯的下降趨勢。由此可得出酶解作用與溫度是密切相關的，低溫會影響酶活性的釋放，適當的溫度可激發酶的作用，而過高的溫度也會破壞酶導致其失活。全程蛋白損失率與酶解溫度成正比，可見溫度增加會造成蛋白損失，該結果符合蛋白質本身特性。故酶解溫度不宜過高，以55 ℃左右為宜。

圖4 酶解溫度對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

2.2.4 酶解pH對馬齒莧粗多糖除蛋白率和多糖損失率的影響

由圖5可知，除蛋白率在酶液pH=6.0時出現較為明顯的峰值。表明溶液系統的酸堿環境直接影響木瓜蛋白酶酶解的效果，弱酸環境有利于酶解，該結果與木瓜蛋白酶產品說明書提供的相關信息相符。酶解pH環境的變化對多糖損失率無顯著影響。因此，最佳酶解pH=6.0。

圖5 酶解pH對馬齒莧粗多糖除蛋白率和 多糖損失率的影響圖

3 結論

本試驗以除蛋白率和多糖損失率為指標，考察Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、酶法和鹽酸法4種脫蛋白方法對馬齒莧多糖脫蛋白的效果，結果表明酶法明顯優于其他3種方法，為馬齒莧多糖除蛋白較為理想的方法，優化后的工藝為木瓜蛋白酶用量1.5%，酶解時間2.5 h，酶解溫度55 ℃，酶解pH=6.0。該方法除蛋白效率較高，多糖損失率相對較低，方法綠色安全，更適合可食性多糖的除蛋白。