國(guó)標(biāo)高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中 脫氫乙酸含量方法優(yōu)化

◎ 郝 果，安曉娟，王琳帆

（富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 富平 711700）

脫氫乙酸及其鈉鹽作為食品添加劑，是繼苯甲酸鈉、尼泊金、山梨酸鉀之后新一代的低毒高效的防腐劑，對(duì)霉菌和酵母菌的抑菌能力強(qiáng)，為苯甲酸鈉的2～10倍，高劑量時(shí)能有效抑制細(xì)菌繁殖。脫氫乙酸及其鈉鹽被人體各個(gè)組織吸收后分散于血漿和眾多器官中，抑制體內(nèi)多種氧化酶發(fā)揮作用。長(zhǎng)期大量食用脫氫乙酸及其鈉鹽超標(biāo)的食品，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生一定影響[1-2]。

目前常用的防腐劑主要有：山梨酸、苯甲酸和丙酸及其鹽類；沒食子酸、沒食子酸酯、對(duì)羥基苯甲酸酯類、棕櫚酸酯、抗壞血酸；亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽；乳鏈球菌和為他霉素；茶多酚、殼聚糖等。脫氫乙酸及其鈉鹽作為一種新型防腐劑具有突出的優(yōu)點(diǎn)，可耐光、耐熱，且在食品加工過程中不分解或蒸發(fā)，不產(chǎn)生異味，近年普遍受到廣大食品企業(yè)的歡迎[3]。脫氫乙酸及其鈉鹽對(duì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌具有良好的抑制作用，其機(jī)制是通過抑制微生物的呼吸，可有效滲透到細(xì)胞體內(nèi)，以起到防腐、防霉、保鮮等作用，抑制有效濃度為0.5～1.0 g·kg-1，一般用量為 0.3～0.5 g·kg-1。主要用于黃油、腌漬蔬菜、發(fā)酵豆制品、淀粉制品、面包、糕點(diǎn)、焙烤食品、肉制品、復(fù)合調(diào)味品和果蔬汁，糕點(diǎn)中最大用量為0.5 g·kg-1[4]。食品中脫氫乙酸的測(cè)定方法有很多，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]等，其中高效液相色譜法因普及率高、準(zhǔn)確性好而被廣泛應(yīng)用。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》處理復(fù)雜耗時(shí)。本研究參照GB 5009.121—2016，主要采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器，用硫酸鋅溶液沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，再用正己烷除去脂類及糖類等物質(zhì)，最后離心過濾，減少了雜質(zhì)峰的干擾，同時(shí)確定了檢測(cè)器條件，建立了一種準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的糕點(diǎn)類食品中脫氫乙酸含量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）、CPA224S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯儀器有限公司）、KQ-700VDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HC-3018離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.0%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，150 A，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；氫氧化鈉、乙酸鋅（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（色譜純，美國(guó)sigma公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

流 動(dòng) 相：甲 醇：0.02 mol·L-1，乙 酸 銨 水 溶 液（10∶90，V∶V）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm。

1.2.2 樣品前處理

糕點(diǎn)：精確稱取樣品2 g，放入25 mL離心管中，加10 mL水，5 mL 120 g·L-1的硫酸鋅溶液，用20 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5后轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，用水定容，搖勻。將混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，超聲10 min，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加10 mL正己烷，振搖1 min后靜置，待分層后棄去有機(jī)層，再加10 mL 正己烷重復(fù)提取1次，將下層水相置于離心管中， 4 000 r·min-1條件下離心10 min。最后取上清液過 0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液）配制。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用10 mL 20 g·L-1氫氧化鈉溶液溶解，用水定容至刻度線。4 ℃下有效期為3個(gè)月。

（2）脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。分別吸取脫氫乙酸貯備液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10 mL、15 mL、20 mL置于100 mL容量瓶中后用水定容至刻度線，配制成濃度分別為1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

線性是指在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)得的響應(yīng)值與被測(cè)物質(zhì)濃度成比例關(guān)系的程度。以系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積分別為橫、縱坐標(biāo)作圖，觀察是否呈線性。

本實(shí)驗(yàn)用脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液精密配制以下標(biāo)準(zhǔn)系列濃度：1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、 80.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1、150.0 μg·mL-1、 200.0 μg·mL-1，進(jìn)樣量為10 μL，以脫氫乙酸濃度為橫坐標(biāo)、以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，即Y=kX+b。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

線性結(jié)果如圖1所示，該方法的濃度范圍為1.00～200.0 μg·mL-1，線 性 方 程 為Y=28.783 89X-22.820 36，相關(guān)系數(shù)r=0.999 84，線性關(guān)系良好。

圖1 脫氫乙酸的相關(guān)系數(shù)和回歸方程圖

2.2 檢出限及定量限

以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法確定檢出限，采用樣品空白測(cè)定10次，平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算出檢出限。以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法確定定量限，采用樣品空白值，加上10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算出定量限。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖2所示，按檢出限和定量限的驗(yàn)證方法，當(dāng)稱樣量為2.0 g時(shí)，計(jì)算得出檢出限為0.6 mg·kg-1，定量限為2 mg·kg-1，與 GB 5009.121—2016中方法檢出限（2 mg·kg-1）和定量限（5 mg·kg-1）相比，該方法有較高的靈敏度。

圖2 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 樣品的測(cè)定

按照本研究方法對(duì)不同樣品進(jìn)行前處理后用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。由測(cè)定結(jié)果可以看出在3種不同糕點(diǎn)中均檢出脫氫乙酸，且精密度為1.1%～2.6%，RSD均小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的10%。

表1 樣品中的脫氫乙酸含量的測(cè)定表

2.4 精密度

本研究采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的精密度，精密度越小，說明平行性越好。將濃度為200.0 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定7次，分別計(jì)算其出峰時(shí)間、峰面積以及濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此來評(píng)價(jià)精密度和重復(fù)性。

將200.0 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)測(cè)定7次，分別計(jì)算，其保留時(shí)間、峰面積和RSD為0.02%、0.20%和0.20%，精密度良好，其結(jié)果見表2。精密度越小，準(zhǔn)確度越高，數(shù)據(jù)越可靠。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

本研究采用樣品加標(biāo)回收，即在有被測(cè)物質(zhì)的樣品中加入定量的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照樣品的處理方法進(jìn)行處理、測(cè)定、分析，得到的測(cè)定值減去本底值后與理論加標(biāo)值的比值則為加標(biāo)回收率。

精密稱取9份2 g樣品置于25 mL離心管中，分成3組，每組3份平行樣品，加入低、中、高3種不同濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法進(jìn)行處理、測(cè)定、分析。根據(jù)加標(biāo)回收率公式計(jì)算得出其平均回收率。測(cè)定結(jié)果見表3。從表3中可知其回收率的平均值98.3%，范圍為96.4%～101.0%，均在80%～120%范圍內(nèi)，回收率較高，說明本方法對(duì)糕點(diǎn)中脫氫乙酸含量的測(cè)定能起較好的質(zhì)控目的。

表3 糕點(diǎn)中脫氫乙酸的回收率表

2.6 檢測(cè)器的選擇

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》中有2種檢測(cè)方法，一種是氣相色譜法，一種是液相色譜法。液相色譜法可用紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器，但二極管陣列檢測(cè)器對(duì)溫度非常敏感，易導(dǎo)致基線不穩(wěn)定，靈敏度降低，脫氫乙酸在紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器均有響應(yīng)，但其在紫外檢測(cè)器上的響應(yīng)值較大且靈敏度高，故選擇紫外檢測(cè)器。

3 結(jié)論

經(jīng)過優(yōu)化選擇高效液相色譜條件：色譜柱為C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相為甲醇： 0.02 mol·L-1，乙酸銨（10∶90，V∶V）；流速為 1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)293 nm。樣品經(jīng)硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，正己烷除去油脂和糖類，C18柱分離后，對(duì)糕點(diǎn)類樣品中脫氫乙酸含量進(jìn)行測(cè)定。通過測(cè)定線性范圍、檢出限、定量限、精密度以及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，均得到了滿意結(jié)果。本方法檢出限為 0.6 mg·kg-1，定量限為2 mg·kg-1，優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法，說明本檢測(cè)方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能很好的測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量。