豬STIM1基因變異篩選及其與產仔數性狀的關聯分析

吳俊靜　董斌科　喬木　彭先文　武華玉　雷彬　梅書棋

摘要：豬的產仔數是繁殖性狀中重要的經濟性狀。STIM1是一種鈣離子結合蛋白，在卵母細胞成熟、受精以及胚胎早期發育過程中發揮重要作用。鑒定獲得了豬STIM1基因內含子10中的1個新的突變位點g.199893-delT，采用直接測序法在DIV系和大白豬群體中進行了基因分型，并對產仔數性狀進行了關聯分析，結果發現該突變顯著影響母豬的產仔數性狀（P<0.05）。NN基因型母豬總胎次的產仔數和產活仔數顯著高于MM基因型（P<0.05）。

關鍵詞：豬；產仔數；STIM1基因；關聯分析

中圖分類號：S828；S813 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6296-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.051

Abstract： In pig production， litter size has been one of the most important economical traits.Stromal interaction molecule 1 （STIM1） was a transmembrane-spanning Ca2+-binding protein which was essential in oocytes maturation and fertilization， and early embryo development. In this study a novel mutation （g.199893-delT） at intron 10 in porcine STIM1 gene were identified by sequencing. Association results showed that it significantly affected the litter size traits in both DVI line and Large White pigs （P<0.05）. In all parities， the sows with NN genotype had significantly more piglets than that of MM genotype （P<0.05）.

Key words：pig； litter size；STIM1 gene；association analysis

豬的產仔數是繁殖性狀中重要的經濟性狀，直接關系到養豬業的經濟收益。提高豬產仔數對提高養豬業的總體經濟效益意義重大。據統計，在中國如果母豬產仔數每胎增加1頭，每年將增收190億元的純利[1]。母豬產仔數性狀是一個由排卵、受精、著床、胎兒發育等多個具有時間順序特征的組分性狀構成的復合性狀，屬于遺傳力很低（0.1左右）的數量性狀，難以用常規育種技術進行遺傳改良，所以尋找控制豬繁殖率的主效基因及其遺傳標記對提高母豬產仔數具有重要意義。

STIM1（Stromal interaction molecule 1）基因參與調節胞內Ca2+濃度，在哺乳動物卵母細胞中表達，可能參與調節卵母細胞成熟和受精過程。STIM1蛋白能感受內質網內鈣庫Ca2+濃度，從而調節Ca2+內流，參與形成Ca2+釋放激活Ca2+通道（CRAC），引發鈣庫控制的Ca2+內流（SOCE），調控膜內外的Ca2+濃度，與鈣振蕩相關[2-4]。而卵母細胞的減數分裂激活和成熟以及受精過程均受到鈣振蕩的調節[5，6]。2009年，Koh等[7]首次報道STIM1存在于哺乳動物卵母細胞中，并且在豬卵母細胞中STIM1能探測內質網Ca2+濃度，并觸發SOCE。2012年最新研究表明，STIM1在鼠成熟卵母細胞中的表達量遠高于未成熟卵母細胞，且僅在成熟卵母細胞中才能檢測到SOCE[8]。精子刺激后，STIM1在小鼠卵母細胞中迅速遷移，并參與受精過程鈣振蕩的維持[9]。在秀麗新小桿線蟲中發現，STIM1干擾后導致生殖腺形態異常，無法正常排卵，也無法受精[10]，STIM1是秀麗新小桿線蟲正常排卵和繁殖力所必需的[11]。另外，大量研究報道STIM1對腫瘤有抑制作用，如子宮頸癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]等。

綜上所述，STIM1基因與動物繁殖性能有著密切聯系，參與調控卵母細胞成熟及受精過程。目前豬STIM1基因對母豬產仔數的影響還未見報道，本研究篩選鑒定豬STIM1基因多態位點，并與產仔數性狀進行關聯分析，以期獲得母豬產仔數相關的新分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集了24頭梅山豬（湖北省英山縣綠源養豬專業合作社）、174頭大白豬（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所原種豬場）、107頭DIV系豬（華中農業大學實驗豬場）共305頭母豬血樣，并收集其2005-2010年期間的繁殖性狀記錄，主要包括總產仔數（Total number born，TNB）和產活仔數（Number born alive，NBA）。

基因組DNA采用苯酚/氯仿提取法提取。

1.2 豬STIM1基因多態性檢測

根據豬STIM1基因的基因組序列（GenBank登陸號：NC_010451.3）設計引物：上游引物：5′-GCCTTGCCATCCCCTTGA-3′，下游引物：5′-AGAGACCGCCGATACCCC-3′。在大白豬、梅山豬和DIV系豬中，每個品種豬5個樣本混合，進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL，反應體系組成： DNA模板2 μL，10×buffer（含Mg2+） 10 μL，上、下游引物各2 μL、dNTPs 8 μL、TaqDNA聚合酶1 μL，無菌雙蒸水25 μL。PCR的反應程序為：95 ℃預熱4 min；95 ℃變性30 s，64～54 ℃退火30 s（每個循環降低0.5 ℃），72 ℃延伸40 s，共20個循環；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共15個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化產物直接送到北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，對比篩選基因多態性。

1.3 基因分析

利用上述引物，采用上述直接測序法在大白豬和DIV系豬群中進行基因分型。

1.4 統計分析

采用SAS 9.0軟件的GLM模型進行標記的關聯分析。所采用模型為：Yijk=μ+Pi+Sj+Gk+eijk，其中Yijk為性狀表型值，μ為總體均值，Pi為胎次效應，Sj為季節效應，Gk為基因型效應，eijk為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 豬STIM1基因多態性檢測結果

通過混合樣本測序的方法，檢測到豬STIM1基因的1個新突變位點，即位于該基因199 893 bp處的1個T堿基的插入/缺失突變g.199893-delT，并在各豬群中均檢測到3種基因型NN、MN和MM，各基因型測序圖見圖1。

在梅山豬、大白豬和DIV系豬3個群體中檢測了該突變位點的等位基因及基因型頻率分布情況，結果見表1。在大白豬、DIV系、梅山豬3個群體中檢測了豬STIM1基因兩種等位基因的分布頻率，結果見表1。由表1可見，N等位基因頻率在大白豬中較低，僅為19.0%，在DIV系中為40.2%，在梅山豬中最高，達56.3%。

2.2 關聯分析

在大白豬和DIV系豬群體中分析了豬STIM1基因突變位點基因型與母豬產仔數性狀的相關性，結果（表2）發現該突變顯著影響母豬產仔數性狀。在兩個豬群中，NN基因型母豬總胎次總產仔數均極顯著高于MM基因型母豬（P<0.01），且存在總產仔數NN>MN>MM的趨勢。在DIV系中，NN基因型個體的總胎次產活仔數顯著高于MM和MN基因型個體（P<0.05）；在大白豬群中，NN基因型個體的總胎次產活仔數極顯著高于MM基因型個體（P<0.01），MN基因型個體的的總胎次產活仔數與其他兩種基因型間無顯著差異。

3 小結與討論

本研究鑒定獲得了豬STIM1基因的1個新的插入缺失位點g.199893-delT，該位點位于內含子10中。在大白豬、DIV系、梅山豬三個群體中檢測了豬STIM1基因兩種等位基因的分布頻率，發現N等位基因頻率在大白豬中較低，而在梅山豬中最高。這3個群體中，大白豬、DIV系和梅山豬平均每胎產仔數分別為（10.99±1.95）、（11.67±1.77）和（15.21±3.14）頭。由此可見，產仔數越高的群體，N等位基因頻率越高。在大白豬和DVI系豬群中進行了豬STIM1基因突變位點g.199893-delT多態性與母豬產仔數性狀的關聯分析，結果發現，該位點顯著影響母豬的產仔數和產活仔數。攜帶N等位基因的母豬產仔數較高，N等位基因有利于提高母豬產仔數性狀。該位點可作為分子標記用于選育母豬產仔數性狀。

在母豬卵母細胞中，STIM1參與調節鈣離子信號，是產生持續性鈣離子振蕩所必需的因子，其影響卵母細胞的成熟、受精以及隨后的早期胚胎發育過程[7，15]。本研究發現豬STIM1基因的這兩個突變位點可能影響了該基因的轉錄或表達，從而影響母豬卵母細胞的成熟、受精以及早期胚胎的發育，導致產仔數性狀的差異。其具體作用機制還需要做更深入的基因功能方面的研究。

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