基于網絡藥理學探討金柴飲治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制

劉 瑩 ,申 力，王兆博，曹洪欣

(1.中國中醫科學院 中醫基礎理論研究所，北京 100700；2.黑龍江中醫藥大學 基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.中華中醫藥學會，北京 100029）

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）屬于中醫“疫病”范疇，流行廣泛、傳變迅速，具有寒熱毒邪錯雜、邪居肺衛與少陽、虛實并見、邪盛正衰等特點。透邪解毒法是導師曹洪欣教授結合近年突發疫病特點提出的治療方法，用于治療嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、甲流等突發性呼吸道病毒感染類疾病及各類感冒發熱、皰疹性咽峽炎等[1-4]。透邪解毒法防治疫病，一方面給邪以出路，將疫毒之邪透達于外；另一方面扶助正氣，激發人體驅邪能力。新冠肺炎流行初期，曹洪欣教授結合疾病特點及證候特征等，以透邪解毒法組方金柴飲防治新冠肺炎，對新冠肺炎易感人群、無癥狀感染者、確診患者輕型、普通型、重型等具有一定的防治效果[5-7]。金柴飲以小柴胡湯為基礎方，加金銀花、連翹清解熱毒、宣散邪氣，荊芥透邪外出，茯苓健脾祛濕，浙貝母清肺化痰，共奏透邪解毒、宣肺益氣、扶正祛邪之功。本研究采用網絡藥理學的基本方法分析金柴飲對COVID-19的治療作用，預測其潛在分子機制，為深入研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 金柴飲目標化合物篩選

利用中藥系統藥理學數據庫平臺（TCMSP）檢索金柴飲中各藥物的化合物成分，依據口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%且類藥性（druglikeness，DL）≥0.18的2個ADME 限定條件對獲得的化合物成分進行初篩，從而得到金柴飲的活性成分。

1.2 目標化合物靶點預測

將金柴飲中的活性成分分別輸入到PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到相應化合物的“Canonical SMILES”結構，再將其導入到Swiss Target Prediction平 臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），限 定 研 究 物 種 為 人 類（“Homo Sapiens”），預測金柴飲活性成分中的潛在蛋白質靶點。

1.3 新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）靶點收集

以“ novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞，檢索OMIM數據庫（https://omim.org/）與Gene Cards數據庫（https://www.genecards.org/），收集疾病相關基因，合并2個疾病數據庫靶點，刪除重復值，獲得新型冠狀病毒肺炎的相關靶點。

1.4 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點PPI網絡構建

運用韋恩圖在線制作工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），將金柴飲活性成分靶點與疾病基因靶點進行映射，得到交集靶點，即金柴飲治療COVID-19的潛在作用靶點。將這些作用靶點導入STRING11.0數據庫（https://string-db.org/），構建蛋白互作（PPI）網絡模型，將生物種類限定為“Homo Sapiens”，獲得蛋白互作關系，將數據保存為TSV格式文件。導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，利用軟件中的“Network analyzer”功能分析靶點的網絡拓撲參數，根據Degree值的大小排序，篩選出起關鍵作用的功能靶點。

1.5 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點功能與通路的富集分析

將金柴飲治療COVID-19的靶點輸入到Metascape平 臺（https://metascape.org/gp/index.html），P值設為小于0.01，對其進行GO分析及KEGG通路富集分析，保存結果,繪制氣泡圖對各類數據進行可視化。

1.6 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點-通路網絡圖的構建

根據通路預測結果，在Excel表格中建立“化合物-靶點”“靶點-通路”的對應關系，將其導入CytoScape3.8.0，構建化合物-新型冠狀病毒肺炎靶點-通路網絡圖，以該圖來表示金柴飲治療COVID-19“成分-靶點-通路”之間的相互關系。

2 結果

2.1 金柴飲中藥活性成分獲取

通過TCMSP數據庫檢索，初步獲得金柴飲中藥的化合物成分，經ADME值篩選后得到各藥物活性成分共263個，運用Swiss Target Prediction數據庫，得到活性成分靶點共4 476個，合并后刪除重復值共得到靶點979個。藥物活性成分及靶點情況見表1，方中部分化合物基本信息見表2。

表1 金柴飲“化合物-活性成分-靶點”基本信息Tab. 1 Basic information of“ Compound-Active ingredient-Target” in Jinchai Decoction

表2 金柴飲中交集化合物信息表Tab. 2 Information of intersection compounds in Jinchai Decoction

2.2 COVID-19相關靶點獲取

由Gene Cards數據庫收集到COVID-19潛在靶點260個，結合OMIM數據庫補充相應靶點，合并后去除重復值，共得到261個疾病相關靶點。將篩選的金柴飲活性成分靶點與COVID-19疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，得到共同靶點75個，見圖1。

圖1 金柴飲與COVID-19靶點韋恩圖Fig.1 Venn of intersection target of Jinchai Decoction and COVID-19

2.3 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點PPI網絡構建

將共同靶點提交至STRING11.0平臺，得到75個靶蛋白的蛋白質相互作用關系數據，采用Cytoscape 3.8.0軟件繪制靶蛋白PPI網絡圖，見圖2。其中一個靶點TMPRSS11D沒有網絡相互聯系，故剔除。最終包含74個節點，749條邊（若兩個靶蛋白之間存在相互作用關系，則用邊連接兩個靶蛋白），由“Network analyzer”工具篩選出該網絡中degree值（度值）排名前10的靶蛋白，見表3。這些靶點基因可能在疾病治療中發揮重要作用。

表3 金柴飲治療COVID-19的關鍵靶點信息Tab. 3 Key target information of Jinchai Decoction in the treatment of COVID-19

圖2 金柴飲PPI網絡圖Fig.2 PPI network of Jinchai Decoction

2.4 靶點功能與通路富集分析

通過Metascape數據庫分析，共得到GO富集條目1 557條（P＜0.01），包含1 400個生物過程（Biological processes，BP）、106種 細 胞 功 能（Molecular function，MF）、51類 細 胞 組 分（Cell composition，CC）；KEGG 通路富集分析篩選得到152條（P＜0.01）,依據Count值分別選取排名在前的GO條目及KEGG通路繪制氣泡圖，見圖3。結果顯示，這些靶基因在BP方面主要參與細胞因子介導的信號通路、細胞對有機氮化合物、脂質、損傷等的應答過程，見圖3（A）；在MF方面主要涉及磷酸轉移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性等功能，見圖3（B）。參與的通路主要有AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲流等，見圖3（D）。

圖3 金柴飲主要成分潛在靶點的富集分析Fig.3 Enrichment analysis of potential targets of main components in Jinchai Decoction

2.5 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點-通路網絡圖的構建

選取富集基因前20條的關鍵信號通路，建立“成分-靶點-通路”圖，見圖4。體現了金柴飲多成分、多靶點、多通路的作用特點。

圖4 “成分-靶點-通路”網絡圖Fig.4 Network of "Component-Target-Pathway"

3 討論

本研究共篩選出金柴飲中包含261種活性成分，其中豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷等16種化合物存在于2種以上的藥物中。藥理學研究表明，這些化合物多具有抗炎、抗病毒的生物活性，如β-谷甾醇可通過減少NO的合成及抑制IL-6、IL-1、TNF-α等炎性因子的表達等作用而發揮抗炎作用[8]；槲皮素可通過與HA2亞基相互作用阻斷病毒的融合，在A型流感病毒感染早期抑制病毒侵入[9]；山柰酚能夠通過調控NF-κB信號通路抑制IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性細胞因子的釋放而表現出明顯的抗炎功效[10]，且對急性肺損傷具有潛在的治療效果[11]。推斷這些化學成分及其協同作用可能是金柴飲發揮藥效的主要物質基礎。

通過金柴飲核心成分-疾病關系網絡，發現TNF、GAPDH、TP53、IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、CASP3、MAPK8、IL2為關鍵靶標。TNF、IL6、IL2為常見的促炎因子，參與炎性反應，調節免疫應答。研究表明，肺部感染、肺損傷時機體會釋放大量的TNF-α[12]。IL-6為炎癥急性期的反應指標，且在流感病毒性疾病中均呈現出過表達[13-14]。GAPDH是一種具有介導細胞凋亡、DNA修復和自噬等生理作用的多功能蛋白。對急性肺損傷具有保護作用[15]，而核心靶點中的MAPK1、MAPK3、MAPK8在急性肺損傷時常呈現異常表達，通過抑制其作用能夠降低肺損傷的炎癥參數[16]，增強肺泡巨噬細胞的自噬作用[17]。相關研究表明，P53突變能使肺上皮功能損傷[18]，P53基因及EGFR的突變與肺癌的發生息息相關，兩者皆是肺癌的重要生物學標志[19]。綜上可見，這些核心靶基因多與機體免疫系統調節、肺部炎癥反應、肺部損傷等有關。

KEGG富集分析顯示，金柴飲治療COVID-19的信號通路主要涉及AGE-RAGE信號通路、缺氧誘導因子（HIF-1）信號通路、PI3K-Akt信號通路等。AGE-RAGE信號通路可通過誘導激活MAPK、NFκB，致使IL-1a、IL-6、TNF-α等促炎因子和細胞間粘附分子等的表達、釋放，啟動過度的炎癥反應和自身免疫反應，影響氧化應激反應，引起組織損傷[20-21]。此外，晚期糖基化終產物的受體（RAGE）是一種促炎性模式識別受體，在過敏性支氣管炎、肺炎、肺損傷、慢阻肺等疾病中其表達量增加[22]。PI3K/Akt、HIF-1信號通路關系密切，都參與了肺損傷、肺纖維化的發生過程[23-24]。而PI3K/Akt信號通路的激活能夠通過介導細胞自噬、抑制線粒體分裂達到保護肺組織，減輕肺損傷的目的[25-26]。由此推測金柴飲可能通過調控上述相關通路發揮治療作用。

4 結論

基于網絡藥理學的金柴飲作用機制研究表明，金柴飲能夠通過多成分、多靶點、多過程、多通路等多種途徑針對COVID-19的病因、病理改變而發揮抗病毒、抗炎、調節免疫功能、抗氧化應激等作用。本研究預測得到的金柴飲治療COVID-19的內在機制還需要進一步實驗予以驗證，有待深入研究。