廿烷五烯酸單藥和聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡作用原理的研究

李星 安京華

【摘要】目的：研究廿烷五烯酸在單藥和聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用的可能原理。 方法：應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)肺癌細(xì)胞的活性氧水平。結(jié)果：通過(guò)檢測(cè)肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平可知，相比卡鉑組與對(duì)照組而言，EPA組和聯(lián)合組可明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)論：?jiǎn)为?dú)使用廿烷五烯酸或用聯(lián)合卡鉑治療均可使肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，從而使bcl-2表達(dá)減弱，可能是肺癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加的原理之一。

【關(guān)鍵詞】廿烷五烯酸；卡鉑；A-549細(xì)胞；ROS

[中圖分類(lèi)號(hào)]R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）03-0033-02

The study on mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid monotherapy and combination therapy

LI Xing1， AN Jing-hua2 （1. Yufa Town Central Hospital ， Daxing Beijing 102602， China； 2. YanBian University Hospital ， Yanji Jilin 133000， China）[Abstract] Objective： To explore the mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid and carboplatin. Methods： Microplate assay was used to determine Reactive oxygen species （ROS） level of human lung cancer cell line A-549. Results： The level of ROS in EPA group and combined group were significantly higher than those in control group and carboplatin group. Conclusions： ROS lever of EPA group and combined group were obviously increased. expression of bcl-2。That maybe increase the apoptosis of lung cancer cells because ROS can reduce expression of bcl-2.

[Key words] Eicosapentaenoic acid； A-549； ROS

廿烷五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）屬于ω-3多不飽和脂肪酸。PUFAs具有良好的抗癌特性。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一類(lèi)具有生物活性的大分子，它們的抗癌作用是多樣性的。這些多不飽和脂肪酸具有較高的安全性，在體內(nèi)外均可部分選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。它們還通過(guò)增加不同細(xì)胞系對(duì)特定抗腫瘤藥物的敏感性來(lái)提高化療藥物的療效。這些ω-3多不飽和脂肪酸具有多種抗癌作用，但確切的機(jī)制尚不清楚。盡管許多研究已經(jīng)探討了DHA和EPA對(duì)實(shí)體瘤的作用及其機(jī)制，但對(duì)于這兩種FAs在血液惡性腫瘤中的作用及其機(jī)制還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。目前已有實(shí)驗(yàn)表明ω-3 多不飽和脂肪酸在腫瘤疾病的治療中有作用[1-3]，但其抗腫瘤的具體原理尚處于研究中。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)使用EPA單藥和聯(lián)合用藥的不同情況下，研究其誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡增加的可能原理。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人肺癌A-549細(xì)胞株（北京首都醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)）常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液中（含10%新生小牛血清），選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑 EPA：購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；卡鉑：購(gòu)于齊魯制藥有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium） 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫恍律∨Ｑ澹∟ewborn Calf Serum）：武漢三利生物技術(shù)有限公司，置于56℃恒溫水浴箱30min滅活補(bǔ)體，-20℃冰箱保存； ROS試劑盒：購(gòu)于碧云天生物公司。

1.3酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平 將A-549細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，置于六孔板中培養(yǎng)。設(shè)立對(duì)照組，EPA組（EPA 80μg/mL），卡鉑組（卡鉑100μg/mL），聯(lián)合組（EPA 80μg/mL、卡鉑 100μg/mL），每種藥物濃度設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。光密度值（OD值）使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。OD值即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（_x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用藥48h后，卡鉑組與對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化無(wú)顯著性差異，而EPA組和聯(lián)合組則明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，詳見(jiàn)表1。

3 討論

PUFAs是一大類(lèi)脂肪酸（FAs）的成員，在其結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)雙鍵。眾所周知，這些具有生物活性的大分子具有細(xì)胞正常功能所需的各種重要生理作用。這些FAs的許多作用是通過(guò)其更活躍的長(zhǎng)鏈代謝物介導(dǎo)的，這些代謝物通過(guò)改變質(zhì)膜組成、產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)和改變不同基因的表達(dá)而起作用。EPA和DHA是長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（pufa）中的一種，已顯示出多種健康益處。這些FAs通過(guò)調(diào)節(jié)包括血壓、凝血、心律和心率在內(nèi)的多種危險(xiǎn)因素來(lái)降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其次，這些FAs對(duì)多種代謝途徑的調(diào)節(jié)也有一定的作用，使其在治療炎癥疾病、代謝紊亂（如2型糖尿病）和免疫損害條件中具有潛在的治療利用價(jià)值。長(zhǎng)期食用含EPA的食物可顯著增加血漿、血小板和紅細(xì)胞中EPA的含量，且EPA對(duì)惡性細(xì)胞都有選擇性作用，對(duì)正常細(xì)胞的影響較小。EPA的抗腫瘤作用的機(jī)制之一是誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化。其中，保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化的主要細(xì)胞內(nèi)機(jī)制是GP-x4酶，不同細(xì)胞系對(duì)EPA的敏感性可能反映了GP-x4在不同健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的差異表達(dá)。這將影響保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化損傷的能力。

有關(guān)研究報(bào)告顯示，體外EPA處理HL-60和K-562細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞周期延長(zhǎng)，G2/M期縮短，兩種細(xì)胞株的壞死率分別為19.6%和4.4%；此外，EPA在HL-60細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的程度更大，其主要通過(guò)下調(diào)凋亡的主要調(diào)節(jié)因子bcl-2信號(hào)分子的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)，表明EPA（40、60和120μM）可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，但K562細(xì)胞不受EPA對(duì)DNA斷裂的影響。盡管不同的EPA敏感和抗EPA白血病細(xì)胞系表達(dá)不同水平的促凋亡和抗凋亡因子，如c-myc和Bcl-2，但這些因子表達(dá)的差異并不能解釋其對(duì)不同細(xì)胞凋亡的不同影響。

此外，一項(xiàng)研究顯示，EPA對(duì)兩種淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Ramos有誘導(dǎo)壞死和凋亡的作用。使用不同的抗氧化劑逆轉(zhuǎn)EPA的壞死作用，但對(duì)其凋亡作用沒(méi)有任何影響，表明氧化應(yīng)激是EPA誘導(dǎo)壞死的一種手段。EPA誘導(dǎo)的Ramos細(xì)胞凋亡是通過(guò)EPA對(duì)凋亡內(nèi)在途徑的直接作用而不是干擾細(xì)胞周期的進(jìn)展來(lái)介導(dǎo)的。三氮雜合酶C是一種酰基輔酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應(yīng)用揭示了ACS在EPA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的重要作用。使用不同的抗氧化劑逆轉(zhuǎn)EPA的壞死作用，但對(duì)其凋亡作用沒(méi)有任何影響，表明氧化應(yīng)激是EPA誘導(dǎo)壞死的一種手段。EPA誘導(dǎo)的Ramos細(xì)胞凋亡是通過(guò)EPA對(duì)凋亡內(nèi)在途徑的直接作用而不是干擾細(xì)胞周期的進(jìn)展來(lái)介導(dǎo)的。三氮雜合酶C是一種酰基輔酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應(yīng)用揭示了ACS在 EPA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的重要作用。實(shí)體瘤患者的I期和II期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，omega-3 FAs是安全的，并且顯示出有希望的結(jié)果，特別是在治療后這些FAs的血濃度顯著升高的患者中應(yīng)用；需要注意的是，EPA改善癌性惡病質(zhì)的推薦劑量為1.5-2g/天，該劑量的副作用很小，然而，增加劑量的益處尚不清楚。盡管多不飽和脂肪酸增加氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物自由基的產(chǎn)生使其易受氧化損傷這一事實(shí)臨床上有所爭(zhēng)論，但多不飽和脂肪酸的消耗已被證明是臨床安全的。

有研究顯示，癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，可形成高氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少抗凋亡因子bcl-2的表達(dá) [4]，從而增加癌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中使用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺癌A-549細(xì)胞中ROS水平，可以發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組和EPA組與對(duì)照組或卡鉑組相比較，聯(lián)合組和EPA組能顯著引起肺癌A-549細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，且聯(lián)合組升高更明顯。因此推測(cè)，當(dāng)EPA單藥或聯(lián)合卡鉑時(shí)，肺癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，減少了抗凋亡因子bcl-2的表達(dá)，從而引起肺癌細(xì)胞凋亡，為EPA本身及增強(qiáng)卡鉑抗癌作用的原理之一。

參考文獻(xiàn)

[1] 樓健穎， 吳丹， 林漢庭， 等. ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸對(duì)胃癌細(xì)胞株AGS生長(zhǎng)和增殖的影響[J]. 中華普通外科雜志， 2007， 22（8）： 613-615.

[2] 秦薇， 朱圣陶. 二十二碳六烯酸對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制[J].中華臨床營(yíng)養(yǎng)雜志， 2009， 17（1）： 49-52.

[3] 李星， 安京華， 石俊， 等. ω-3多不飽和脂肪酸廿烷五烯酸單劑以及聯(lián)合卡鉑對(duì)人肺腺癌A-549細(xì)胞系增殖和凋亡的影響[J].中華臨床營(yíng)養(yǎng)雜志， 2012， 20（1）： 30-32.

[4] Mao Y， song G， Cai Q， et al. Hydrogen peroxide-induced apoptosis in human gastric carcinoma MGC803 cells[J]. Cell Biol Int， 2006， 30（4）： 332-327.

作者簡(jiǎn)介：李星，北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院。E-mail：lix0226@163. com