胃癌VEGF通路相關(guān)基因的預(yù)后模型的構(gòu)建

田蓮蓮，朱 軍，馬 騫，章屹然，王兆熹，陳 睿

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見消化道惡性腫瘤之一。據(jù)估計(jì)，中國平均每年約有200萬人死于胃癌，占全球胃癌死亡人數(shù)的近1/2[1]。早期胃癌治療效果較好，但檢出率很低，大多數(shù)患者（＞70%）檢出時(shí)已發(fā)展為晚期胃癌。部分患者甚至失去進(jìn)行手術(shù)切除的機(jī)會(huì)或者發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此晚期胃癌總體預(yù)后較差[2-4]。故對(duì)于胃癌的預(yù)后預(yù)測是臨床工作中的重點(diǎn)內(nèi)容且具有較大價(jià)值。除了分級(jí)分期系統(tǒng)，可以尋找一些新穎的手段進(jìn)行預(yù)后預(yù)測。

研究表明腫瘤的生長和擴(kuò)張與腫瘤內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展密切相關(guān)[5]。血管生成受到某些關(guān)鍵分子的調(diào)節(jié)。其中，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是驅(qū)動(dòng)腫瘤血管生成的最重要因素之一。VEGF家族由7個(gè)成員組成：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和胎盤生長因子。這些蛋白質(zhì)主要通過內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的特異性酪氨酸激酶受體起作用。這些分子中的大多數(shù)通過血小板運(yùn)輸，并在血液凝固過程中，由血小板脫顆粒后釋放到血清中，只有小部分在血液中自由循環(huán)[6]。研究發(fā)現(xiàn)阻斷血管生成是預(yù)防腫瘤生長的良好策略[5]。由于VEGF在大多數(shù)人類癌癥中的表達(dá)增加以及與腫瘤微血管密度增加和預(yù)后不良相關(guān)，因此VEGF通路已成為抗血管生成治療的主要靶標(biāo)[7]。靶向VEGF治療（如貝伐單抗、雷莫蘆單抗）聯(lián)合化療已被證實(shí)具有抗腫瘤活性，具有較好的耐受性和安全性，可改善胃癌患者生存率[8-9]。因此篩選出胃癌VEGF通路相關(guān)基因，建立一個(gè)立足于胃癌VEGF通路相關(guān)基因預(yù)后模型，對(duì)于預(yù)后評(píng)估或?yàn)閭€(gè)體化治療提供新視角，甚至作為靶向治療的有效性指標(biāo)，具有重大臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從TCGA官網(wǎng)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，其中包括癌組織375例和癌旁組織32例。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床生存數(shù)據(jù)匹配，最終完整臨床信息的胃癌患者共計(jì)371例。VEGF通路相關(guān)基因集在GSEA官網(wǎng)（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）的MSigDB (Molecular Signatures Database)數(shù)據(jù)庫下載。其中包括BIOCARTA VEGF PATHWAY和REACTOME SIGNALING BY VEGF。以這2個(gè)VEGF數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，進(jìn)行GSEA富集分析。外部數(shù)據(jù)集來自GEO數(shù)據(jù)庫，下載胃癌基因芯片數(shù)據(jù)GSE84437，用于驗(yàn)證VEGF通路基因預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后提取模型基因，最后用生存曲線的方式驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性。

1.2 GSEA富集分析 GSEA富集分析是使用GSEA軟件（版本4.0.1），并且使用1000次排列數(shù)。按照癌組織與癌旁組織分為2組，富集上述已經(jīng)下載的2個(gè)VEGF通路基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：基因數(shù)目大于15個(gè)，P值小于0.05，標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)絕對(duì)值（Standardized enrichment fraction，NES）大于1.2。

1.3 篩選差異表達(dá)的VEGF通路相關(guān)基因 在癌組織與癌旁組織的全轉(zhuǎn)錄組中提取VEGF通路相關(guān)基因219個(gè)。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，對(duì)差異基因進(jìn)行差異性分析。通過Benjamin-Hochberg方法對(duì)P值進(jìn)行校正。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P＜0.05。

1.4 構(gòu)建預(yù)后模型及繪制ROC曲線 將上述VEGF通路差異表達(dá)基因與胃癌基本臨床信息合并。使用生存曲線和單因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出與預(yù)后相關(guān)基因。隨后進(jìn)行多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，采取向前向后法，篩選出赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）最小的模型，并且得到模型中各個(gè)基因的比例系數(shù)β。然后根據(jù)公式計(jì)算每位患者的風(fēng)險(xiǎn)值，以中位數(shù)為界限將患者人群分為高風(fēng)險(xiǎn)組（大于中位數(shù)）和低風(fēng)險(xiǎn)組（小于中位數(shù)），其中風(fēng)險(xiǎn)值的計(jì)算公式為：β1×expression(gene 1) +β2×expression(gene 2) + …βn×expression(gene n)。ROC曲線用來驗(yàn)證模型的預(yù)測能力。最后使用R語言中timeROC包分別繪制1、3年和5年的ROC曲線并且計(jì)算相應(yīng)AUC。

1.5 構(gòu)建VEGF通路基因相關(guān)列線圖 使用R語言rms包繪制列線圖和校正圖進(jìn)一步驗(yàn)證模型基因的臨床價(jià)值。列線圖被廣泛用于癌癥預(yù)后，主要是因?yàn)樗鼈兡軌驅(qū)⒔y(tǒng)計(jì)預(yù)測模型簡化為針對(duì)個(gè)別癌癥患者情況而定的事件（例如死亡或復(fù)發(fā)）概率的單個(gè)數(shù)值估計(jì)[10]。用于生成這些估計(jì)值的用戶友好型圖形界面有助于使用列線圖來告知患者臨床決策[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)方式都是在R軟件（版本：3.63）中完成。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)檢驗(yàn)使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。生存分析結(jié)果采用Kaplan-Meier曲線，其檢驗(yàn)方式為Log-Rank法。所有檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析篩選并確定VEGF通路相關(guān)基因的胃癌預(yù)后模型。本研究中相應(yīng)的R語言數(shù)據(jù)包有：survival包、edgeR包、rms包、timeROC包及一些R語言自帶的基礎(chǔ)繪圖包。

2 結(jié)果

2.1 差異基因在VEGF通路顯著富集 GSEA結(jié)果顯示，與胃癌正常的癌旁組織（藍(lán)色）比較，癌組織（紅色）在2個(gè)VEGF通路上顯著富集（P＜0.05，NES＞1.2）（圖1）。這表明在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF通路的異常激活起到了重要作用。

圖1 癌組織與癌旁組織差異基因在VEGF通路顯著富集

2.2 胃癌VEGF通路基因的差異表達(dá) 2個(gè)VEGF通路提取的基因共219個(gè)，使用差異分析的方式篩選出154個(gè)差異基因（P＜0.05）。其中34個(gè)基因下降，120個(gè)基因上升。為了建立最優(yōu)的模型，對(duì)logFC沒有限定（|logFC|＞0）。這也驗(yàn)證了大部分的VEGF基因在癌組織與癌旁組織異常表達(dá)。

2.3 預(yù)后模型的篩選與確定 首先對(duì)上述154個(gè)VEGF差異基因進(jìn)行與生存數(shù)據(jù)的合并。使用單因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，確定了28個(gè)與預(yù)后相關(guān)的VEGF通路基因（P＜0.05），用于后續(xù)模型的構(gòu)建。通過多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析建立模型，前進(jìn)后退法篩選最小AIC值，最終確定6個(gè)基因組成的預(yù)后模型，這6個(gè)基因分別為錨蛋白重復(fù)域1（ankyrin repeat domain 1，ANKRD1）、整聯(lián)蛋白α-Ⅴ（integrin alpha-V，ITGAV）、內(nèi)皮一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS3）、神經(jīng)菌毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）、Ⅵ型膠原蛋白α3（collagen type Ⅵ alpha 3，COL6A3）、骨膜素（periosteal protein，POSTN）。可得，風(fēng)險(xiǎn)值的計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)值=0.0269×ANKRD1+0.0181×ITGAV+0.0697×NOS3+0.0549×NRP1+ (－0.0078)×COL6A3 +0.005×POSTN。

2.4 預(yù)后模型的評(píng)估 根據(jù)計(jì)算公式得到每位患者的風(fēng)險(xiǎn)值，按照二分法（中位數(shù)）將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)2組。Kaplan-Meier曲線顯示：高風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后要遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.05）(圖2A）。高風(fēng)險(xiǎn)組的中位生存期為1.66年，低風(fēng)險(xiǎn)組的中位生存期為4.60年。繪制時(shí)間依賴的ROC曲線，結(jié)果顯示，該模型的1、3年和5年AUC分別為65.4%、72.2%和73.0%（圖2B）。這表明該模型可以較為準(zhǔn)確的預(yù)測胃癌患者預(yù)后。

圖2 預(yù)后模型的評(píng)估

2.5 預(yù)后模型獨(dú)立于臨床因素指導(dǎo)預(yù)后 首先通過單因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選胃癌預(yù)后相關(guān)臨床因素，并繪制森林圖。單因素森林圖顯示年齡（風(fēng)險(xiǎn)值=1.026，95%CI：1.008～1.044），TNM分期（風(fēng)險(xiǎn)值=1.534，95%CI：1.241～1.896）和本模型（風(fēng)險(xiǎn)值=1.235，95%CI：1.153～1.323）與胃癌預(yù)后息息相關(guān)（P＜0.05）。隨后將上述結(jié)果進(jìn)一步納入多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，仍然顯示年齡（風(fēng)險(xiǎn)值=1.033，95%CI：1.014～1.052），TNM分期（風(fēng)險(xiǎn)值=1.593，95%CI：1.279～1.985）和本模型（風(fēng)險(xiǎn)值=1.239，95%CI：1.146～1.339）與胃癌患者預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 預(yù)后模型獨(dú)立于臨床因素指導(dǎo)預(yù)后

2.6 GEO外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證 為了進(jìn)一步確認(rèn)模型的預(yù)測能力，下載GEO數(shù)據(jù)庫中胃癌數(shù)據(jù)集GSE84437，與臨床資料合并后使用生存曲線的方式驗(yàn)證。生存曲線表明：高風(fēng)險(xiǎn)的患者（中位生存時(shí)間：3.5年）預(yù)后遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于低風(fēng)險(xiǎn)的患者（中位生存時(shí)間：10.0年）（P＜0.05）（圖4）。提示在不同的環(huán)境下，該模型對(duì)胃癌的預(yù)后具有較好的預(yù)測能力。

圖4 GEO數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證預(yù)后模型：高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生存分析

2.7 臨床運(yùn)用 為了進(jìn)一步將這6個(gè)VEGF通路相關(guān)基因在臨床運(yùn)用，繪制了列線圖（圖5A）。列線圖顯示，每個(gè)基因?qū)?yīng)一個(gè)分?jǐn)?shù)，最后得分是每個(gè)基因分?jǐn)?shù)累加所得。根據(jù)每位患者的這6個(gè)基因的表達(dá)水平，可以通過查詢列線圖得到患者1、3年和5年生存率。同時(shí)為了驗(yàn)證列線圖的預(yù)測準(zhǔn)確性，繪制了校正圖。校正圖顯示3年的預(yù)測與真實(shí)情況較為接近，說明VEGF通路相關(guān)基因預(yù)后模型在胃癌患者預(yù)后預(yù)測中具有較好的準(zhǔn)確性（圖5B）。

圖5 列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證

3 討論

胃癌是第五大最常見的惡性腫瘤，是全球癌癥死亡的第三大主要原因[11]。胃癌患者表現(xiàn)出“三高三低”的特征：發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率和病死率高；早期診斷率、根治性切除率和5年生存率低[12-14]。早期胃癌患者接受根治性手術(shù)后再進(jìn)行化療，術(shù)后5年生存率為90%；晚期胃癌進(jìn)行連續(xù)化療治療，但預(yù)后很差。多數(shù)患者診斷時(shí)已發(fā)展為晚期胃癌，因此對(duì)胃癌預(yù)后預(yù)測具有較大的臨床運(yùn)用價(jià)值。

腫瘤血管生成和淋巴管生成通過促進(jìn)向腫瘤細(xì)胞輸送氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，在實(shí)體腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起著至關(guān)重要的作用[6]。內(nèi)皮抑素是內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制劑。它通過限制腫瘤的血液供應(yīng)來抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，從而剝奪腫瘤營養(yǎng)，被認(rèn)為是治療惡性腫瘤的潛在抗癌標(biāo)志物[15]。VEGF參與腫瘤血管生成，研究表明靶向VEGF治療具有抗腫瘤生長的作用[16]。在進(jìn)展期胃癌中，分子靶向治療已經(jīng)成為聯(lián)合治療方案之一。貝伐單抗為重組人克隆抗體，通過抑制VEGF生物學(xué)活性對(duì)腫瘤血管生成起到抑制作用并可在一定程度上阻斷腫瘤血供，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。

本研究通過生物信息學(xué)確定了6個(gè)VEGF通路的胃癌預(yù)后基因。ANKRD1在卵巢癌中的高表達(dá)與生存不良有關(guān)，而在卵巢癌細(xì)胞系中與鉑耐藥相關(guān)[17]。ITGAV的過表達(dá)與經(jīng)由神經(jīng)周圍浸潤的結(jié)直腸癌的更高進(jìn)展和擴(kuò)散有關(guān)[18]。NOS3是鈣依賴型酶，可調(diào)節(jié)血管功能，并且在激活的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一氧化氮[19]。NRP1是一種跨膜糖蛋白，可作為許多細(xì)胞外配體（包括Ⅲ/Ⅳ類信號(hào)蛋白，VEGF的某些同工型和轉(zhuǎn)化生長因子β）的共受體[20]。NRP1對(duì)于介導(dǎo)VEGF對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用也至關(guān)重要，這主要是因?yàn)樗鼈兛梢杂绊懮L因子受體和整聯(lián)蛋白功能。一些研究表明，靶向NRP1或NRP2可以抑制腫瘤發(fā)生并降低腫瘤對(duì)其他療法的抵抗[21]。COL6A3是CRC的獨(dú)立預(yù)后因子，主要在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中表達(dá)[22]。而且獨(dú)立于腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期，COL6A3突變與總體生存期顯著相關(guān)[23]。POSTN基因編碼整聯(lián)蛋白的配體，整聯(lián)蛋白是促成細(xì)胞外基質(zhì)與整聯(lián)蛋白之間結(jié)構(gòu)連接形成的關(guān)鍵粘著斑蛋白之一。POSTN基因高表達(dá)與許多人類惡性腫瘤相關(guān)[24]。總之，本研究模型中的VEGF通路相關(guān)基因都與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)合本研究多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析建立的預(yù)后模型及生存分析和外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，提示本研究所構(gòu)建的預(yù)后模型基本符合臨床研究和基礎(chǔ)研究，具有一定的臨床預(yù)測能力。

本研究首次通過GSEA富集驗(yàn)證胃癌的發(fā)生發(fā)展與VEGF通路相關(guān)基因激活相關(guān)，并且建立了胃癌VEGF通路相關(guān)基因預(yù)后模型。使用生存分析和外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了該模型預(yù)測的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。同時(shí)本研究通過繪制列線圖的方式，將模型基因納入列線圖，使得該模型的臨床運(yùn)用更加簡潔。挖掘的6個(gè)VEGF相關(guān)基因?yàn)槲赴┑陌邢蛑委熖峁┝诵碌膯l(fā)和思路，并可能為胃癌的個(gè)體化治療提供新視角。本研究的不足之處在于只是從生信角度出發(fā)，尚需臨床試驗(yàn)及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。