浙粟3號的EMS誘變條件篩選

石麗敏 呂學高 朱正梅 宋費玲 盧華兵

（浙江省農業科學院玉米與特色旱糧研究所 東陽322100）

粟米（Setaria italic L.），北方俗稱谷子，原產于我國，是最古老的作物之一，去殼后是小米[1]。在禾谷類作物中，粟米的營養價值最高而且營養相對平衡，不僅含有豐富的蛋白質(9%～16%)、脂肪(3%～7%)、淀粉，還含有多種氨基酸、維生素和礦質元素[2]，能夠滿足人體生理代謝較多方面的需要，調節人們的膳食營養結構，隨著人們物質生活水平的不斷提高，小米也受到越來越多的消費者喜愛。谷子具有耐貧瘠、耐干旱、抗逆性強等特性，尤其適合在山區干旱地區種植[3]。在浙江很多地方都有種植粟米的傳統習慣，浙粟3號是浙江省農業科學院玉米與特色旱糧研究所從地方種中優選純化所育成的適合浙江地區種植的粟米品種，是高產優質的糯小米類型，缺點就是株高偏高，易倒伏[4]。筆者希望能夠利用誘變手段創制出矮稈突變體材料，對其進行株高改良。甲基磺酸乙酯（Ethylmethan sulfonate，EMS）誘變是一種簡便高效且應用最廣泛的方法，能夠誘發DNA分子發生點突變，不易對染色體造成畸變，穩定性好，而且相較于其他誘變方式，EMS誘變成本低廉、操作簡便、重復性高，因而被廣泛用于突變體的創造，成為種質資源創新和基礎研究獲取突變體材料的一種有效手段[5-6]。目前EMS誘變已成功地應用于玉米[7-8]、水稻[9-11]、小麥[11-13]、大豆[14-15]等多種作物的突變體材料創制與育種上，在谷子上應用EMS誘變創造突變體材料雖然起步較晚，但是也有一些報道[3,16]。但由于不同的材料對EMS誘變劑的敏感性不同，其半致死劑量也存在顯著差異，因此針對不同的材料確定其適宜的處理條件是化學誘變工作中關鍵的一步。本試驗以不同預處理方式、EMS濃度及處理時間處理浙粟3號，以確定EMS處理浙粟3號的適宜條件，提高誘變效率，為獲得更多浙粟3號突變體材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

浙粟3號種子由浙江省農業科學院玉米與特色旱糧研究所提供，試驗用種子經過精挑細選，確保每粒飽滿。

1.2 化學試劑

1.2.1 EMS原液 甲基磺酸乙酯，純度＞99%，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 磷酸緩沖液 1 000 mL的磷酸緩沖液配方為6.8 g磷酸氫二鉀和291 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加蒸餾水稀釋至1 000 mL,調節pH至7。

1.2.3 不同濃度（體積百分數）的EMS溶液 用pH為7的磷酸緩沖液作為EMS的稀釋劑，配制不同濃度的EMS溶液，以0.4%EMS溶液配制為例，用移液槍吸取EMS原液400μL，加入磷酸緩沖液定容至100 mL，搖晃均勻即配制完成，需現配現用。

1.3 試驗方法

試驗采用正交設計法，因素A為種子預處理，設3個水平分別為不浸泡的干種子、清水浸種12 h過夜和磷酸緩沖液浸種12 h過夜。因素B為不同EMS濃度（體積百分數）處理，設5個水平，EMS濃度依次為0.4%、0.8%、1.0%、1.2%和1.5%。處理C為EMS誘導時間，設4個水平，分別為浸泡處理2 h、4 h、6 h和8 h，共60個處理組合。處理過程在TS-100C恒溫搖床上進行，溫度設置20℃，振蕩速度100 r/min。EMS處理完后，立即將種子取出于流水下沖洗30 s，然后每個處理挑選100粒飽滿種子放置于鋪有濾紙的培養皿中（濾紙預先用清水浸透），設2次重復，將培養皿置于光照培養箱中，設置溫度26℃，每日光照16 h，每日下午補清水1次。7 d后調查發芽率。

1.4 數據統計與分析

種子發芽率（%）=發芽種子數÷測定樣品種子數×100%。利用統計分析軟件DPSS 19.0對統計數據進行多因素方差分析和鄧肯氏（Duncan）多重比較。

2 結果與分析

通過對預處理方式、EMS濃度、處理時間3個主體對因變量種子發芽率的效應的檢驗表明（表1），預處理方式、EMS濃度和處理時間均對種子發芽率影響極顯著（P值即Sig值<0.01）。

表1 預處理方式、EMS濃度、處理時間對種子發芽率影響的方差分析結果（主體間效應的檢驗）

2.1 預處理方式對種子發芽率的影響

結合表2和圖1可知，3種預處理方式中，除了1.0%EMS濃度處理2 h清水浸種和干種子發芽率相同外，清水浸種種子發芽率最高，磷酸緩沖液浸種種子發芽率最低。經過多重比較分析表明，清水浸種處理與干種子、磷酸緩沖液浸種處理種子發芽率差異極顯著，干種子與磷酸緩沖液浸種處理種子發芽率無顯著差異。且3種方式預處理后，種子發芽率都隨著EMS濃度增加和處理時間延長整體呈降低趨勢。

2.2 EMS濃度對種子發芽率的影響

以不浸種干種子為例，結合圖1和表2可以看出，當EMS濃度低于1.0%時，隨著EMS濃度增加，種子發芽率逐漸降低；當EMS濃度高于1.0%，處理時間分別為2 h和4 h，種子發芽率呈現先升高再降低的趨勢，處理時間分別為6 h和8 h，種子發芽率呈較平穩下降趨勢。經過多重比較分析表明，除了EMS濃度1.0%與1.2%之間種子發芽率差異不顯著外，其他幾個濃度間種子發芽率差異都極顯著，說明種子發芽率隨著EMS濃度的增加總體呈下降趨勢不變。

圖1 不同預處理方式對種子發芽率的影響

2.3 EMS處理時間對種子發芽率的影響

由表2和圖2可知，隨著EMS處理時間的增長，不同預處理及不同EMS濃度處理種子發芽率都是逐漸降低的。多重比較分析結果表明不同處理時間之間種子發芽率差異極顯著。

圖2 各因素影響下種子發芽率變化趨勢

表2 不同處理下種子的發芽率（%）

3 討論

近年來，EMS被廣泛用于多種作物誘變育種和突變體庫構建，種子經EMS處理后的致死效應最先表現在種子發芽率，播種后會繼續表現為成苗率、生長量等指標的降低及組織器官等形態的改變。產生這些效應的基礎是研究材料中細胞水平和分子水平的誘變效應，包括細胞分裂受抑制、生長點分生組織細胞受損傷、生長素受破壞、染色體變異及遺傳物質核酸和一系列生物大分子蛋白質在結構上的變化等[18]。因此，選擇合適的誘變劑量是誘變研究中獲得較高突變頻率、構建理想突變體庫的關鍵，本研究中把半致死劑量即種子發芽率的50%作為標準來篩選適宜的誘變條件[19-21]。誘變條件的確定是構建一個成功突變體庫的重要前提[17]，也是突變體材料創制的第一步。EMS能夠抑制種子的萌發，不同的EMS處理條件對種子的發芽率影響不同，發芽率又能間接反映誘變效果，研究結果表明，預處理方式、EMS濃度、處理時間均對種子發芽率影響極顯著，無論是低濃度或是高濃度的EMS溶液處理浙粟3號種子，種子萌發能力均受到抑制作用，且隨著EMS濃度的增大、處理時間的延長，抑制作用隨之增強，與前人研究結果一致。

EMS處理不同植物的最佳條件是不同的，例如黃瓜品種SK-1最適的EMS誘變條件為2.1%EMS浸種12 h[22]，高粱品種BTx623最佳的EMS誘變條件是0.2%EMS浸種20 h[23]，花生品種中花5號的EMS最佳誘變條件是0.9%EMS浸種7 h，或者1.2%EMS浸種5 h[18]。EMS處理同一植物不同品種的最佳條件也是不同的，目前已有報道的幾個谷子品種的最佳誘變條件也各不相同，豫谷1號的最佳誘變條件為種子清水浸種過夜，1.0%EMS處理8 h[24];晉谷21的最佳誘變條件是將提前清水浸過的種子用1.0%EMS處理10 h[25]，十里香的最佳誘變條件是用濃度1.2%EMS處理16 h[17]。以半致死量為標準，本研究確定了浙粟3號種子的最佳誘變條件：干種子，用濃度0.4%EMS處理4 h。

李偉等[24]研究結果表明，在相同濃度EMS處理下，清水浸泡過夜的谷子種子較未浸泡的發芽率低，認為在相同濃度、相同處理時間下使用清水浸種過夜，能夠更好地發揮EMS的作用，使EMS能較快 地滲入種子胚中。宋振君等[17]發現用1×PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）提前浸種6.5 h后，在相同濃度EMS處理下，未提前浸種的十里香種子較浸種的種子的發芽勢和發芽率均降低。本研究同時表明清水浸種、磷酸緩沖液浸種和不浸種在相同濃度EMS處理下，清水浸種發芽率顯著高于不浸種的種子發芽率，而不浸種與緩沖液浸種對種子發芽率影響差異不顯著，與前人研究結果不同。根據試驗結果推測，使用清水浸種過夜，種子充分吸水，根據滲透勢原理，相當于稀釋了EMS濃度，種子所受到的傷害顯著少于相同濃度、相同處理時間下的其他種子。