奈達鉑對腫瘤患者骨髓巨核細胞及血小板相關凋亡蛋白 影響的研究

韓忠麗，于柏清，李和義，卜夢昕，張曉杰，王武龍

(包頭醫學院第二附屬醫院 腫瘤科，內蒙古 包頭 014030)

0 引言

奈達鉑(Nedaplatin)是目前第二代鉑類化合物，具有類似于順鉑的抗實體瘤活性，相比傳統的順鉑類藥物，其腎臟毒性和胃腸道反應均更低，且無需水化，操作便捷[1]。但其仍屬于化療藥物，所產生的不良反應仍然存在，其中血小板下降(Chemotherapy Induced Thrombocytopenia，CIT)在奈達鉑化療中較為常見，究竟奈達鉑對惡性腫瘤患者巨核細胞與血小板的體內抑制作用至今未見任何報道，而本課題組前期的研究表明奈達鉑顯示出很強的抗腫瘤效果[2]。因此，本研究擬從骨髓巨核細胞及外周血血小板兩個研究層面檢測奈達鉑對腫瘤患者骨髓巨核細胞及血小板相關凋亡情況，初步明確奈達鉑對惡性腫瘤患者血小板下降的細胞凋亡機制，同時也有助于開發出新的策略來有效防止血小板下降的發生，也指導臨床探究更加適宜、簡便的預測血小板下降發生的預測因素而應用于臨床。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取包頭醫學院第二附屬醫院2020年1月至2020年6月使用奈達鉑化療后第7～14d，并發生Ⅱ至Ⅲ度血小板抑制的惡性腫瘤患者30例作為研究對象，納入研究組，其中男20例，女10例；年齡35～75歲，平均(56.48±5.32)歲；病程1～5年，平均(3.12±0.68)年。另選取同期健康人群30例，納入對照組，其中男16例，女14例；年齡35～75歲，平均(56.48±5.32)歲；病程1～5年，平均(3.12±0.68)年。兩組患者一般資料對比，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：①均與相關惡性腫瘤的診斷標準相符[3]。②接受奈達鉑化療后出現血小板抑制；③具備正常的認知能力，可配合完成此次研究。④均取得研究對象知情同意。排除標準：拒絕或者無法配合此次研究者。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器

注射用奈達鉑(齊魯制藥有限公司 國藥準字H20050563)；Partec PAS流式細胞儀(德國PARTEC公司)，Stat Fax 2100酶標儀(美國Awareness公司)；caspase -3抗體和caspase-9抗體(美國CST公司)，β-actin抗體和β-tubulin抗體(北京博奧森公司)，Protein A/G PLUS-Agarose (美國SANTA CRUZ公司)，HRP標記的山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)和HRP標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，ECL顯影試劑盒(美國Milipore公司)，PVDF膜(美國Milipore公司)，ANA(美國sigma公司)。

1.2.2 檢測方法

流式細胞儀檢測PS膜外表達。ELISA檢測可溶性P-選擇素的釋放，Western biot檢測Caspase-3和Caspase-9的表達以及免疫共沉淀分析Bci-XL和Bak蛋白的相互作用。

1.3 統計學處理

全文數據使用SPSS 19.0軟件計算，所有統計檢驗均符合正態分布。計量資料將采用“均數±標準差”，計數資料以率(%)表示，根據資料類型，行描述性統計分析、兩個獨立樣本t檢驗，多個樣本采用F檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 奈達鉑對Caspase-3和Caspase-9的表達影響

研究組PS膜外表達陽性率及可溶性P選擇素均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 奈達鉑對 Caspase-3和Caspase-9的表達影響(±s)

表1 奈達鉑對 Caspase-3和Caspase-9的表達影響(±s)

可溶性P 選擇素(ng/mL)研究組 30 8.59±2.22 75.30±6.44對照組 30 14.56±2.47 90.63±8.74 t - 10.286 56.738 P - 0.001 0.001組別 例數 PS膜外表達 陽性率(%)

2.2 免疫共沉淀檢測

在血小板裂解液中不加BCL-XL抗體為陰性對照然后進行共沉淀實驗。Western blot雜交后沒有發現BCL-XL和Bak條帶，保存7d的血小板，研究組中BCL-XL和Bak蛋白的結合量較高，約為對照組的2.6倍，與對照組相比差異有統計學意義(t=16.89，P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫共沉淀檢測

2.3 奈達鉑對 Caspase-3和Caspase-9的表達影響

保存7d的血小板，研究組中Caspase-3、caspase-9活性形式占總量的百分比均明顯小于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 奈達鉑對 Caspase-3和Caspase-9的表達影響

3 討論

我國居民主要死亡原因之一為惡性腫瘤，儼然成為危害國民生命健康、制約社會經濟發展重大疾病之一[4]。而化療是惡性腫瘤治療中不可替代的治療手段之一，而鉑類藥物則作為臨床不可或缺的化療藥物在基礎科研與臨床應用中發揮著重要的作用。自1965年Rosenberg發現第一代鉑類藥物順鉑(Cisplatin)以來，鉑類藥物的基礎研發和臨床應用研究發展迅速，目前已經有順鉑、卡鉑(Carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、奈達鉑(Nedaplatin)和洛鉑(Lobaplatin)等藥物被廣泛臨床應用[5]。鉑類藥物自臨床應用以來，其治療的不良反應也一直是臨床關注的重點和熱點，尤其是卡鉑、奈達鉑和洛鉑所致的CIT尤為顯著，已經成為限制鉑類藥物臨床應用的主要原因。臨床上對于CIT的處理主要包括：減少鉑類藥物的使用劑量和(或)延遲化療的進程，血小板懸液的輸注以及各種促血小板生長的生物學因子，如rhIL-11、rhTPO、SCF的應用[6]。這些方法均存在著各自不同的不良反應和高昂的價格，這些均極大地限制了其臨床使用。因此，基礎與臨床醫務人員均渴望探尋出CIT的發生機制，并尋求更加適宜、簡便的預測CIT發生的預測因素而服務于臨床。

研究認為[7]，鉑類藥物中的鉑原子與DNA結合形成的不同結構的化合物是鉑類藥物產生生物學效應的主要因素，這些結構、親和力不同的化合物也是鉑類藥物產生毒副反應的主要原因，在骨髓抑制發生的任何環節，血小板的生成和成熟都可能會受到明顯的抑制。鉑類藥物在誘導細胞DNA損傷時可以激活多種細胞凋亡的信號傳導途徑，這樣，如果傳導途徑被異常激活或者被抑制的時候，就會產生相應的生物學效應。包括巨核細胞在內的骨髓中的多種細胞也會受到影響。研究表明，Bcl-xL蛋白對于巨核細胞的存活具有非常重要的作用，在腫瘤患者化療后，由于促凋亡蛋白Bax和Bak被活化，包括巨核細胞在內的骨髓中多種細胞會受到影響，因此，化療對血小板和巨核細胞的毒性與其血小板數量減少相關。Benjamin T. Kile研究發現，CIT與Bcl-2家族蛋白相關，Bcl-2家族凋亡蛋白會促進細胞死亡，而一些蛋白則促使細胞存活。這一研究可能會顛覆傳統的認為巨核細胞發生類似細胞死亡的過程后才形成血小板的理論。由此研究提示，血小板并不是由巨核細胞發生類似細胞死亡后形成的。巨核細胞形成血小板這一過程中，Bcl-2家族中促凋亡蛋白并非關鍵蛋白。化療通過激活Bcl-2家族蛋白來影響巨核細胞，從而影響了化療期間血小板的生成數量和功能。由此證實了此效應與Bcl-2蛋白在血小板形成過程中的作用，以及對CIT作用的影響[8]。

綜上所述，奈達鉑對惡性腫瘤患者血小板下降的細胞凋亡機制與Caspase-3、caspase-9活性形式減少有關，同時受BCL-XL和Bak蛋白結合量升高的影響。