高血壓腦出血后血紅蛋白對NO、Peroxynitrite的影響及臨床意義

謝騰，劉華明，李斌，張純偉，羅寶昌，袁紅剛，喻小平，劉文，黃志軍

(湖北省漢川市人民醫院/武漢大學人民醫院漢川醫院神經外科，湖北 漢川 431600)

0 引言

高血壓腦出血是一種常見的，危害極大的腦血管疾病。作為腦卒中高發國家，我國高血壓腦出血年發病率高達50.6/10萬～80.7/10萬。位居我國老年人三大死亡原因之首[1]。然而，到目前為止高血壓腦出血缺乏根本有效的治療方法。血腫周圍腦水腫的形成與發展是腦出血患者病情惡化、致殘、致死的主要原因，也是評估腦出血患者神經功能預后的可靠指標[2]。研究表明，腦出血后紅細胞崩解所釋放的血紅蛋白(Hb)可能是導致血腦屏障損傷的重要病理介質之一，能夠誘導、加重腦水腫形成，但是其潛在的分子機制仍不明確。一氧化氮(NO)是一種具有雙重作用的調節分子，由一氧化氮合酶 (主要包括神經元型一氧化氮合酶(nNOS)，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS))以L-精氨酸為底物合成。在氧化應激情況下，NO與超氧陰離子(O2-)所形成的代謝產物過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)是一種毒性大、破壞性極強的氧化硝化產物。在多種中樞神經系統疾病，如腦缺血、腦栓塞、創傷性腦損傷及急性細菌性腦膜炎中，大量產生的peroxynitrite可導致明顯的血腦屏障破壞、腦水腫形成及神經功能缺損。然而，高血壓腦出血后Hb對NO/ peroxynitrite的影響仍不明確。本研究擬探討高血壓腦出血后Hb對NO、Peroxynitrite的影響及臨床意義，為今后高血壓腦出血的治療提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、儀器和動物

血紅蛋白(美國sigmal公司，批號：H7379)，一氧化氮檢測試盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所)，鼠抗3-硝基酪氨酸抗體(美國Abcam公司)，兔抗claudin-5(美國Novus公司)，驢抗鼠熒光二抗-594(美國Invitrogen公司)，3-硝基酪氨酸Elisa檢測試劑盒(美國Abcam公司)，GAPDH(美國CST公司)(大鼠多功能腦立體定向儀(美國Stoelting公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)，石蠟切片機(德國Leica公司)，多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，激光共聚焦熒光顯微鏡及成像系統(日本OLYMPUS公司)。SPF級健康成年雄性SD大鼠140只，體質量280～300 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 實驗分組及模型制作

按隨機數字表法將SD大鼠分為假手術(Sham)組和高血壓腦出血(HICH)組，每組按觀察時間不同再分為6h、12h、1d、2d、3d和7d 共6個亞組。動物模型建立：參照Zeng等[3]方法制備大鼠高血壓腦出血模型。用內徑0.2 mm的銀夾狹窄雙側腎動脈造成大鼠腎血管性高血壓，術后60d形成穩定的高血壓后，在立體定位下向腎血管性高血壓大鼠右側尾狀核(前囟前0.2 mm，矢狀縫右3.0 mm，深6mm) 緩慢勻速注入20uL血紅蛋白(濃度：150g/L)，誘導腎血管性高血壓腦出血大鼠模型。造模后大鼠左側前肢回收屈曲，右側前肢伸展；向左側推大鼠時阻力較右側降低；有向左側旋轉的行為。判斷為造模成功，否則為失敗。假手術組大鼠按同法造成腎血管性高血壓后，向右側尾狀核內注入等量生理鹽水。

1.3 實驗方法

1.3.1 ELisa法檢測腦組織及血清中3-硝基酪氨酸變化

麻醉大鼠后，打開胸腔，心臟穿刺抽取2mL全血，室溫下靜置2h，離心(4000轉，10min)取上清，儲存于-80℃冰箱備用。同時，斷頭取腦，取Hb損傷處周圍腦組織約100mg，加入等量生理鹽水搗碎、勻漿，3000 轉離心30min取上清，同法儲存備用。Elisa檢測方法如下：往預先包被3-NT抗體的微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌，然后底物TMB顯色。用多功能酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD)值，計算樣品濃度。

1.3.2 硝酸還原酶法檢測腦組織及血清中NO含量

血清及腦組織制備方法同Elisa檢測。按照硝酸還原酶法測定血清和腦組織中NO水平。采用BCA法測定腦組織中的蛋白濃度。血清中NO含量表示為μmol/L，腦組織中NO含量表示為μmol/gprot。

1.3.3 免疫熒光檢測3-硝基酪氨酸的表達、細胞定位及其與緊密連接蛋白claudin-5的位置關系

石蠟切片制作：麻醉大鼠后并固定，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液行心臟灌注。切取損傷處腦組織，于4%多聚甲醛溶液中浸泡24h后，按照常規石蠟包埋法制成石蠟標本并切片，切片厚度為3-5μm，撈片、風干后備用。免疫熒光檢測：石蠟切片脫蠟至水，在檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復25-30min，血清封閉后滴加一抗，4℃孵育12-24h，PBS溶液沖洗后滴加相應熒光二抗，37℃孵育1h。熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察、拍照、分析。熒光雙染(3-Nitrotyrosine與CD68；3-Nitrotyrosine與Claudin-5)時，兩種一抗混勻后再孵育，相應的熒光二抗也需混勻孵育。

1.3.4 Westernblot法檢測腦組織中緊密連接蛋白claudin-5的表達變化

大鼠深度麻醉后，斷頭取腦，取Hb損傷處及周圍腦組織約100mg，-80℃冰箱或液氮中保存備用。組織標本經勻漿、裂解、超聲破碎、離心后，采用Bradford法蛋白定量。蛋白裂解液依次經過電泳、轉膜、孵育一抗(claudin-5：1:800)及二抗、顯影及定影。GAPDH(1:1000)作為內參。凝膠成像系統掃描并分析claudin-5蛋白表達變化。

1.3.5 腦組織水含量測定

在不同時間點深度麻醉大鼠、斷頭取腦，沿中線切開左右兩側大腦半球，去除小腦和腦干后，用電子分析天平稱量造模側鼠腦半球濕重。將腦組織放入烤箱中烘烤(100℃，持續24h)，再次用電子天平稱其干重。腦組織含水量(%)=[(濕重—干重)/濕重]×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ONE-WAY方差分析，多重比較用LSD-t檢驗或Dunnett’s T3檢驗。3-NT水平與腦水含量和神經功能缺損之間的相關性采用Spearman秩相關分析，以*P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點腦組織中腦水含量的變化

與Sham相比，HICH組高血壓大鼠腦水含量從6h開始逐漸升高，24h達到最大值，維持在較高水平直至3d，后逐漸下降。HICH組大鼠在各時間點腦水含量均明顯高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.05)，如表1所示。(不同時間點的Sham組中，腦水含量變化差異無統計學意義，P>0.05)。

表1 術后不同時間點兩組大鼠腦水含量變化 (mean ± SD)

2.2 不同時間點血清及腦組織中NO水平變化

Sham 6h組和HICH組各時間點血清及腦組織中NO水平變化見表2。HICH組血清中NO在6h開始下降，12h明顯降低，隨后24h至48h又相對增加但仍低于假手術組；在3d時降至最低，而7天時又有所回升。與Sham 6h相比，HICH組12h、24h、48h、3d和7d時血清中NO含量均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。而腦組織中NO在6h也開始下降，但12h時開始升高，3d時達到最高值，而在7d時又明顯下降但仍高于Sham 6h組。與Sham 6h組相比，HICH組12h、24h、48h和3d腦組織中NO含量均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 不同時間點血清及腦組織中peroxynitrite水平變化

由于過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)具有不穩定性，3-nitrotyrosine(3-NT)可作為peroxynitrite產生可靠的生物學標志[4]。如表2所示，Elisa檢測結果提示HICH注入后6h高血壓大鼠血清中的3-NT水平開始增加，后逐漸上升，在第48h達到峰值，然后逐漸下降；而腦組織中的3-NT水平呈現相同的趨勢，不同的是其在第3d達到峰值。不同HICH組血清和腦組織中的3-NT水平與Sham 6h組之間差異有統計學意義(P<0.05)。此外，免疫熒光觀察顯示腦組織中3-NT也呈現相似的表達趨勢(如圖1所示)；熒光雙染顯示3-NT主要表達在CD68陽性的小膠質細胞/巨噬細胞中，如圖2所示。

圖1 高血壓腦出血(HICH)后不同時間點3-NT的表達

圖2 3-硝基酪氨酸(3-NT)的細胞定位

表2 各組高血壓腦出血大鼠中腦組織和血清中NO、3-NT水平比較(mean±SD)

2.4 緊密連接蛋白claudin-5的表達、分布變化及其與3-NT的位置關系

Claudin-5與3-NT熒光雙標顯示(圖3A)，在Sham 3d組中，表達完整、連續的claudin-5血管周圍無明顯的3-NT表達；而在HICH 3d組中，血腫周圍腦組織血管壁上claudin-5表達、分布明顯減少，而其毗鄰部位卻發現大量密集的3-NT產生。此外，WesternBlot結果也提示，在HICH 3d，血腫周圍組織中緊密連接蛋白claudin-5表達也明顯減少(圖3B)，差異有統計學意義(P<0.01)，提示3-NT的形成與血腦屏障破壞之間可能存在緊密聯系。

圖3 A Sham 3d組和HICH 3d組中3-NT與Claudin-5的熒光雙標(標尺=30um)

圖3 B Westernblot檢測Sham 3d組和HICH 3d組中Claudin-5的表達水平

2.5 相關性分析

不同時間點HICH大鼠腦水含量變化與腦組織中3-NT含 量 變 化(r=0.771，P=0.001，4A)和 血 清 中3-NT水 平 變化(r=0.824，P=0.001，4B)之間均有顯著正相關性。不同時間點HICH大鼠腦水含量變化與腦組織中NO含量變化之間也存在顯著正相關性(r=0.592，P=0.001，4D)，而與血清中NO水平變化之間則存在一定的負相關性(r=-0.327，P=0.034，4E)。不同時間點HICH大鼠血清中3-NT含量變化與腦組織中的3-NT水平有顯著的正相關性(r=0.922，P=0.001，圖4C)。

圖4 不同指標間相關性分析

3 討論

高血壓腦出血(HICH)是最常見的腦血管病之一，也是神經外科最常見的急危癥之一[5]。在我國，高血壓腦出血約占急性腦血管病的20%—30%，其致死率和致殘率均占腦血管病患者的首位[6]。腦水腫的形成是腦出血后最嚴重的并發癥，而且相對增加的水腫程度被認為是可靠的預測神經功能缺損指標[7]。報道顯示，紅細胞崩解所產生的Hb能夠誘導、加重腦水腫形成[8]，但是其潛在的分子機制仍不明確。

一氧化氮(NO)是一種具有雙重作用的調節分子，既有神經血管保護功能，也可發揮神經毒性作用，主要取決于其來源、濃度以及周圍微環境中的氧化還原狀態。據Chiang報道，在腦出血患者腦脊液中NO含量明顯升高且與臨床預后呈負相關[9]。而Rashid等證實在急性中風患者中，血漿NO水平是降低的，且其降低的程度與中風的嚴重程度和預后密切相關[10]。我們的實驗研究發現，高血壓腦出血大鼠腦組織中的NO含量在多數時間點呈現升高趨勢，而血清中NO水平在不同時間點卻大部分是降低的。其主要原因可能是：(1)高血壓本身可導致內皮功能不良及內皮來源的NO合成減少[10]； (2)NO與血液中的氧合血紅蛋白結合而被清除或被血管中的中性粒細胞消耗所致[11]；(3)在氧化應激情況下，激增的活性氧和活性氮類代謝產物Peroxynitrite不僅可消耗大量NO(本實驗中大鼠腦組織和血清中的Peroxynitrite水平均明顯增加)而且可明顯抑制eNOS或iNOS表達與活化[12-14]；(4)異常的或脫偶聯eNOS直接產生O2-與血液中的NO反應產生Peroxynitrite所致[12]。此外我們也發現，高血壓腦出血大鼠腦組織中的NO產生水平與大鼠腦出血后腦水含量之間有明顯的正相關性；而血清中的NO產生水平與大鼠腦水含量之間則存在一定的負相關性，與前人研究結果基本一致[9,10]。由此我們可知，高血壓腦出血后血清中NO水平不一定與腦組織的NO水平一致。

在氧化應激情況下，NO與超氧陰離子(O2-)結合可迅速產生過氧化亞硝酸鹽(peroxynitrite)。近年來，越來越多的證據顯示：NO的細胞毒性作用主要取決于Peroxynitrite的形成[4]；此外也有研究提示：peroxynitrite可能是真正介導腦出血后持續性腦損傷的原因[15,16]。其主要理由是：Peroxynitrite具有很強的特異性的反應性以及具有強大的侵襲能力(主要表現為高的擴散率和高的細胞膜穿透率)[17,18]。據報道，Peroxynitrite滲透系數比超氧化物快約400倍，在其被質子化或者清除前，它可以對其周圍6個細胞直徑范圍內的微環境產生損傷性影響[17]。腦出血后腦水腫的形成主要包括細胞毒性水腫和血管源性水腫。相似地是，Peroxynitrite也涉及上述兩種類型的水腫形成，主要解釋如下：(1) Peroxynitrite可直接激活MMP-9或通過硝化修飾MMP-2的半胱氨酸殘基導致其活化，從而間接破壞BBB，導致血管源性腦水腫[19,20]； (2) Peroxynitrite能夠硝化細胞色素C還原酶(復合體Ⅲ)和ATP合酶(復合體Ⅴ)等，從而損傷細胞的能量代謝；此外，Peroxynitrite能夠修飾Na-K-ATP酶的半胱氨酸殘基，抑制Na-K-ATP酶的活性，從而導致胞漿離子失衡及伴隨的細胞毒性腦水腫[4]。在我們的研究中，Hb注入高血壓大鼠腦內后，腦水含量從6h開始增加，24h達到最大值，維持在較高水平直至3-7d，后逐漸下降。有趣地是，高血壓大鼠腦出血后，腦組織中3-NT水平變化與腦水含量之間具有明顯的相關性。此外，熒光雙標分析顯示，HICH后3d，3-NT表達明顯的部位，毗鄰血管表達的claudin-5則明顯減少，這表明peroxynitrite的產生可能是導致BBB破壞的主要原因之一，而BBB的破壞則可加重腦水腫的形成。研究證實，通過peroxynitrite清除劑FeTPPS清除腦出血后產生的過多peroxynitrite，可明顯抑制血腫周圍MMP-9的活化，改善腦出血后神經血管損傷[21]。因此，我們推測Peroxynitrite很可能是高血壓腦出血后Hb介導腦水腫形成的主要原因。

大量的證據顯示，在多種繼發性中樞神經損傷中，Peroxynitrite可導致BBB破壞、內皮功能失調、神經元及膠質毒性等。通過抑制或清除Peroxynitrite，可以逆轉或減輕其損害作用，如改善BBB通透性增加，減輕腦水腫形成及改善神經功能缺損等[12,21,22]。我們的研究發現，高血壓腦出血大鼠血清中3-NT在不同時間點表達水平與腦組織中的3-NT水平有明顯的相關性。更有意義地是，血清中的3-NT水平與腦水含量的變化之間也具有顯著的相關性。因此，我們推測Peroxynitrite可能是一個可靠的判斷HICH后腦水腫嚴重程度的生物學指標。