二精方顆粒劑質量標準研究

趙雨，褚海清，王結鑫，王倩，張立明,2,3*

(1.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

0 引言

二精方顆粒劑是由枸杞、黃精兩味中藥材配伍通過現代制劑技術制成的一種制劑，在古方《圣濟總錄》中記載二精方以丸劑為劑型，以蜜調和，主“筑氣益精、補填丹田，活血駐顏，長生不老”[1]。本研究前期實驗表明，對Ⅱ型糖尿病小鼠進行二精方多糖及黃酮類提取物干預，其具有降糖降脂、緩解糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀[2-4]，因此，將其開發成具有降糖功效的顆粒劑，且顆粒劑療效迅速，能滿足患者攜帶使用方便、易于貯存的愿望。

目前，關于二精方顆粒的質控標準還未見報道。方中兩味藥材枸杞和黃精均為益陰藥，且所含多糖類成分和黃酮類成分較多，枸杞的現代研究表明其枸杞多糖具有抵抗衰老、保護神經和心血管、抗氧化和預防糖尿病的作用[5-6]，黃精中的主要活性成分多糖和黃酮類也具有抗氧化、降低血糖血脂、調節免疫力等作用[7]。基于上述研究及前期的實驗證明枸杞、黃精中的多糖及黃酮類成分對糖尿病具有一定的預防和治療作用。鑒于此，本研究旨在建立二精方顆粒劑中枸杞和黃精的TLC鑒別法，多糖類及黃酮類成分的高效液相色譜法(HPLC)，以期為該制劑的質量標準提供依據。

1 材料

1.1 儀器

KQ-250E型超聲波器(昆山市超器有限公司)；恒溫水浴鍋(北京長源實驗設備廠)；循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；電子計重秤(廈門佰倫斯電子科技有限公司)；粉碎機(屹立工貿有限公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；分析天平(梅特勒-托利多)；高效液相色譜儀(Agilent 1260)。

1.2 試藥

枸杞(批號：070101，產地：寧夏，石家莊市柏林藥材加工廠)；黃精(批號：070101，產地：四川，石家莊市柏林藥材加工廠)標準品：D-葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506)；D-甘露糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：140651-201504)；蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)。

2 方法與結果[8-9]

2.1 枸杞的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備

取本品1.0 g，研細，加水70 mL，加熱煮沸15min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯30mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至l mL，即得。

2.1.2 對照藥材溶液的制備

取枸杞子對照藥材0.5 g，加水35 mL，加熱煮沸15min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯15mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至l mL，即得。

2.1.3 陰性對照液的制備

按處方除枸杞外的藥材制備顆粒，據2.1.1項下處理，即得。

2.1.4 TLC鑒別

照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3：2：1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果，在枸杞對照藥材色譜相應的位置上，供試品品顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照物干擾，見圖1。

圖1 枸杞的薄層色譜鑒別

2.2 黃精的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品l.0 g，研細，加70%乙醇 20 mL，加熱回流1h，抽濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇l mL使溶解，即得。

2.2.2 對照藥材溶液的制備

取黃精對照藥材l.0 g，加70%乙醇 20 mL，加熱回流1h，抽濾，濾液蒸干，殘渣加水10mL 使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇l mL使溶解，即得。

2.2.3 陰性對照液的制備

按處方除黃精外的藥材制備顆粒，據2.1.1項下處理，即得。

2.2.4 TLC鑒別

照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5：2：0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果，在黃精對照藥材色譜相應的位置上，供試品品顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照物干擾，見圖2。

圖2 黃精薄層色譜圖

2.3 二精方中多糖類成分的含量測定

2.3.1 色譜條件

安捷倫 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8)(A)：乙腈 (B)=84：16 等度洗脫；流速為 1 mL·min-1，檢測波長：250 nm，柱溫為 30℃，進樣量為 10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取葡萄糖、甘露糖分別置于試管中，分別加入0.3 mol·L-1的NaOH溶液5 mL振蕩溶解，取溶解后的溶液100 μL，加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液50 μL，70℃水浴中反應30 min后冷卻至室溫，加0.3mol·L-1的鹽酸100 μL中和，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，針筒式微孔濾膜過濾，濾液作為多糖類成分對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取本品，研細，取約5 g，加水溶解，加入氯仿-正丁醇(4：1)混合溶液脫蛋白，劇烈振蕩后離心，得上清液，加入95%的乙醇，靜置過夜后過濾，所得沉淀依次用 95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干得精制多糖。取精制多糖50 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃ 烘箱中水解8 h，吹干，殘渣加甲醇1 mL，使溶解，吹干，加水使溶解，即得多糖水解液。在水解液中加 1.2 mL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，1 mL的氫氧化鈉溶液，混勻，置水浴加熱，取出，冷卻至室溫，加鹽酸溶液調節至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，針筒式微孔濾膜過濾，即得。

將制備的供試品與標準品分別注入液相色譜儀進行檢測，記錄HPLC譜圖。色譜圖見圖3。

考慮到基于UDP/IP棧的《RSSP-I安全協議》源自于阿爾斯通公司的《FSFB/2安全協議》，已廣泛應用于大鐵路信號系統軌旁設備之間的安全通信，因此互聯互通CBTC系統車地安全通信解決方案直接采用《RSSP-I安全協議》來執行安全通信，并分別部署在與功能安全相關的車載和地面信號設備中。

圖3 二精方顆粒多糖類成分HPLC色譜圖

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察

精密吸取“2.3.2”項下標準品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄甘露糖、葡萄糖峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，標準品溶液濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得葡萄糖回歸方程為y=5114.2x-212.52(r=0.9998，n=6)；得甘露糖回歸方程為y=5839.1x - 369.59(r=0.9996，n=6)。表明葡萄糖和甘露糖分別在0.17~4.18 mg/mL、0.19 ~4.75 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.3.4.2 精密度考察

精密吸取“2.3.3”項下供試品溶液，連續進樣6次，記錄面積，結果，甘露糖、葡萄糖RSD值為0.74%、0.31%。

2.3.4.3 穩定性考察

精密吸取“2.3.3”項下供試品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h分別進樣，記錄峰面積，結果，甘露糖、葡萄糖RSD為0.35%、0.26%。

2.3.4.4 重復性考察

取同一批次顆粒，按“2.3.3”項下方法平行制備6份樣品，進樣，記錄峰面積，結果，甘露糖、葡萄糖RSD為0.39%、0.22%。

精密稱取已知含量樣品6份，分別加入“2.3.2”項下標準品溶液，按“2.3.3”項下處理，進樣，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，甘露糖和葡萄糖RSD分別為0.14%、0.29%(n=6)，表明加樣回收率良好。

2.4 二精方中黃酮類成分的含量測定

2.4.1 色譜條件

安捷倫 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈：水：冰乙酸 =5：94.5：0.5(A)和乙腈：水：冰乙酸 =70：29.5：0.5(B)；梯 度 洗 脫 條 件：0-14 min：100%-86%(A)；14-22 min：86%-84%(A)；22-40 min：84%-70%(A)；40-60 min：70%-100%(A)；流速為 1 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫為30℃，進樣量為 10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁，置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至10 mL。過0.22 μm濾膜，取續濾液即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

取本品，研細，取約5 g，精密稱定，加入乙醇，超聲提取兩次，濾過，合并濾液，減壓濃縮，濃縮液經HPD-600型大孔樹脂，蒸餾水除去水溶性雜質后，50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，微孔濾膜過濾，即得。

將制備的供試品與標準品分別注入液相色譜儀進行檢測，記錄HPLC譜圖。色譜圖見圖4。

圖4 二精方顆粒黃酮類成分HPLC色譜圖

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系考察

精密吸取蘆丁標準品溶液，稀釋，得不同濃度標準液。分別吸取上述溶液1 μL進樣，記錄蘆丁峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，以溶液濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。得蘆丁回歸方程為y=24349x+31.064(r=1.0000，n=6)。結果，表明蘆丁在0.16~8.00 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.4.4.2 精密度考察

精密吸取供試品溶液10 μL，連續進樣測定6次。結果，RSD值為2.53%。

2.4.4.3 穩定性考察

精密吸取供試品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h 分別進樣，記錄峰面積，結果，RSD為2.04%。

2.4.4.4 重復性考察

取同一批次顆粒，按“2.4.3”項下方法平行制備6份樣品，進樣，記錄峰面積，結果，RSD為3%。

2.4.4.5 加樣回收率考察

精密稱取已知含量樣品6份，分別加入“2.4.2”項下標準品溶液，按“2.4.3”項下處理，進樣，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，蘆丁RSD為0.56%(n=6)，表明加樣回收率良好。

2.5 二精方顆粒含量測定

取三批次枸杞-黃精顆粒樣品，按上述含量測定的方法進行含量測定，計算葡萄糖、甘露糖、蘆丁含量，結果見表。根據三批樣品的含量測定結果可知，葡萄糖的平均含量為3.94 mg/袋，甘露糖為0.27 mg/袋，蘆丁為0.06 mg/袋。

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

二精方顆粒處方中以枸杞和黃精中的多糖類和黃酮類活性成分作為含量測定的主要指標。研究表明，白素芬[10]等

表1 三批樣品含量測定結果

人研究二精丸多糖可明顯降低糖尿病大鼠血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)含量，對糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀有所緩解。王偉[11]等研究表明寧夏枸杞總黃酮能使損傷的人臍靜脈內皮細胞抗氧化作用顯著提高，對糖尿病引起的心血管疾病具有一定調節功能。除此之外，本研究在前期的實驗中，通過建立枸杞-黃精提取物化學成分指紋圖譜和譜效關系，確定其共有峰并鑒定出多糖類物質有葡萄糖和甘露糖[12]，黃酮類物質有蘆丁；經動物實驗確定葡萄糖、甘露糖以及蘆丁可能為發揮降糖作用的有效成分。因此，研究通過測定樣品中葡萄糖、甘露糖、蘆丁的含量來對二精方顆粒的質量進行控制，并進行方法學考察。結果顯示，該方法穩定可行。

3.2 含量測定結果分析

對3批二精方顆粒樣品的含量測定結果顯示，葡萄糖的平均含量為3.94 mg/袋，甘露糖為0.27 mg/袋，蘆丁為0.06 mg/袋。擬制定含量限度為：二精方顆粒每袋以葡萄糖(C6H12O6)計，不得少于3.9320 mg；每袋按甘露糖(C6H12O6)計，不得少于0.2714 mg。每袋按蘆丁(C27H30O16)計，不得少于0.0604 mg。