木犀草素聯合白藜蘆醇對裸鼠肝癌移植瘤生長的抑制作用及機制研究

戴盈英

(蘇州市第九人民醫院藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

0 引言

肝癌是一種常見的，致死率極高的惡性腫瘤，致死率在惡性腫瘤中排名第四[1]。隨著環境污染和病毒感染(乙型肝炎和丙型肝炎)的不斷盛行，肝癌的發病率持續居高不下，已成為危害全球人類健康的重要公共健康問題[2]。手術切除、肝移植、射頻消融術和化療藥物(索拉非尼)是目前治療肝癌的只要措施[3]。然而，診斷不及時、肝癌的轉移和復發及藥物的副作用和耐藥性等問題，嚴重影響了目前的臨床治療效果[4,5]。研究表明，肝癌的中位生存率僅1年左右[6]。因此，尋找安全有效的抗肝癌藥物及治療方案迫在眉睫。

天然產物因其結構新穎、安全、含量豐富，成為尋找抗腫瘤藥物的重要資源。木犀草素(Luteolin，Lut)和白藜蘆醇(Resveratrol，Res)為廣泛存在于水果和蔬菜中且被認為基本無毒的天然產物，除了具有廣泛的抗炎、抗氧化作用外，也是公認的抗癌天然產物[7,8]。木犀草素可誘導人肺癌、結腸癌和肝癌細胞周期停滯，促進細胞老化和凋亡[9]。白藜蘆醇則可有效抑制乳腺癌、食管癌和肝癌的生長、擴散和轉移[10]。但因其生物利用度低，療效欠佳，單獨大劑量使用，亦可能產生耐藥性等缺點，嚴重限制了其臨床應用。期研究發現，木犀草素和白藜蘆醇聯用可通過協同抑制NF-κB的激活，發揮高效抗肝癌細胞(HepG2)生長的作用。本實驗旨在探討木犀草素和白藜蘆醇聯用的體內抗肝癌活性及機制。

1 材料與方法

1.1 BALB/c裸鼠、細胞及試劑

SPF級 BALB/c裸鼠 (4-6周齡；18-22 g)共計 15只，均購自蘇州大學實驗動物中心，置恒溫(25±2)℃、恒濕、無菌獨立通風籠中飼養，適應性飼養一周后開始試驗；人肝癌細胞株(HepG2)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，細胞培養于DMEM完全培養基(含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素)中，并置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養箱中維持生長；木犀草素、白藜蘆醇、索拉非尼均購自美國Sigma公司；FBS、DMEM高糖培養基和100×青霉素/鏈霉素均美國Hyclone公 司；GAPDH、NF-κB、p-NF-κB、Bcl-2、Bcl-2、Bax、和Caspase-3抗體均購自英國abcam公司；ECL顯色試劑盒、逆轉錄試劑盒和通用RT-PCR試劑盒均購自上海Beyotime公司。本研究方案獲得動物倫理委員會批準。

1.2 肝癌荷瘤裸鼠模型建立及藥物干預

胰酶消化HepG2細胞，臺盼藍染色并計數，每只BALB/c裸鼠腋下注射100 μl細胞懸液(約含1×106個HepG2細胞)。待腫瘤體積生長至50 mm3左右時，動物被隨機分成5組，每組3只裸鼠，分別為：溶劑對照組(Vehicle)，動物每天灌胃相同體積的生理鹽水；木犀草素組(50 mg/kg)，動物每天灌胃給予50 mg/kg的木犀草素水溶液；白藜蘆醇組(100 mg/kg)，動物每天灌胃給予100 mg/kg的白藜蘆醇水溶液；聯合用藥組(Lut50 mg/kg + Res100 mg/kg)，動物每天灌胃給予50 mg/kg木犀草素和100 mg/kg白藜蘆醇的混合水溶液；陽性藥組(Sorafenib，30 mg/kg)，動物每天灌胃給予30 mg/kg的索拉菲尼水溶液，持續3周。實驗期間每隔4天記錄一次裸鼠腫瘤體積和體重。腫瘤體積 (mm3)=L1×(L2)2×0.5236，L1和L2均有游標卡尺測量獲得，其中L2為腫瘤短直徑，L1為腫瘤長直徑。給藥3周后，腹腔注射過量戊巴比妥鈉(200 mg/kg)對動物進行安樂死，然后剝離腫瘤組織，記錄大小并保存在-80℃冰箱中用于后續Western blot實驗。

1.3 qRT-PCR實驗

TRIzol提取腫瘤組織總RNA，Nano1000測定RNA濃度，同時確保A260/A280在1.8-2.0范圍內，逆轉錄及RT-PCR步驟均參考試劑盒說明書。引物序列見表1，引物均由上海生工設計合成。以GAPDH作為內參。使用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達。

表1 PCR引物序列

1.4 Westernblot實驗

稱取適量腫瘤組織，使用手持式勻漿器在RIPA裂解液中勻漿，4℃ 12000 rpm離心15 min，BCA法測定蛋白上清的濃度。使用8-10% SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白，將分離后的蛋白電轉移至活化后的PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1-2 h，TBST清洗30s后，轉移至稀釋好的一抗溶液中，4℃孵育過夜；次日使用TBST清洗PVDF膜三遍，每次5min，將膜轉移至稀釋好的HRP標記二抗溶液中，室溫孵育1-2 h，TBST清洗(3次，每次5min)，ECL顯色液顯色并拍照。以GAPDH作為內參對蛋白進行均一化比較，使用Image J進行半定量分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 Lut、Res對裸鼠皮下肝癌移植瘤生長的影響

給藥3周結束后，剝離腫瘤組織并稱重，結果發現，Lut(50 mg/kg)、Res(100 mg/kg)、Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg) 和Sorafenib (30 mg/kg)組與溶劑對照組相比，腫瘤組織明顯減小，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組最為明顯，其效果優于陽性對照藥 (Sorafenib)(圖1A)；Lut(50 mg/kg)、Res(100 mg/kg)、Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)和Sorafenib(30 mg/kg)組腫瘤質量分別為：(0.43±0.03)g、(0.40±0.05)g、(0.21±0.03)g和 (0.28±0.06)g，與溶劑對照組(0.59±0.05)g顯著降低(P均<0.05)，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組腫瘤質量顯著低于Sorafenib(30 mg/kg)組(P<0.05)(圖1B)；在治療過程中，各給藥組可顯著抑制移植瘤的生長，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)抑制效果最為顯著(圖1C)，各給藥組小鼠體重與溶劑對照組相比，略有減輕，但無統計學意義 (P均 >0.05)(圖1D)。

圖1 Lut、Res對裸鼠皮下肝癌移植瘤生長的抑制作用

2.2 Lut、Res對腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的影響

各給藥組與溶劑對照組相比，腫瘤組織中NF-κB活性被顯著抑制，Bcl-2的mRNA及蛋白水平顯著下調(P均<0.05)，而Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白水平顯著上調(P均<0.05)，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組的效果最為顯著，展現出較好的體內協同作用。見圖2、圖3和表2。

圖3 Lut、Res對腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響

表2 腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達比較(±s)

表2 腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達比較(±s)

注：與Vehicle組相比，*P<0.05;與Lut組相比，#P<0.05;與Res組相比，&P<0.05。

Groups p-NF-κB Bcl-2 Bax Caspase-3 Vehicle 100 100 100 100 Lut 62.03±8.34* 73.22±9.68* 232.44±15.75* 193.65±12.34*Res 58.12±7.62* 66.93±8.54* 254.35±17.66* 211.35±14.89*Lut+Res 28.91±5.12*#& 19.11±4.63*#& 423.89±26.99*#& 342.67±22.79*#&

圖2 Lut、Res對腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA含量的影響

3 討論

據報道，全球每年新增肝癌患者超過70萬人，由于缺乏有效的治療藥物和手段，死亡率也一直居高不下[11]。近年來，藥物聯合抗癌成為研究的熱點，為藥物治療肝癌帶來新的希望?；谇捌隗w外研究結果，本實驗首次發現Lut(50 mg/kg)與Res(100 mg/kg)聯合給藥可顯著抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤生長，具有一定的協同抗肝癌作用。

核轉錄因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)在腫瘤組織中異常表達并參與多種基因的調控，其中包括細胞增殖、凋亡、血管再生、轉移和耐藥相關基因[12-14]。研究發現，抑制NF-κB的激活可有效治療膀胱癌和黑色素瘤[13,15]。木犀草素和白藜蘆醇作為兩種常見的天然產物，體內外均有較好的抗癌活性。Chen等[16]發現，腹腔注射給予50 mg/kg木犀草素可顯著抑制裸鼠食管癌移植瘤的生長。Ji等[17]研究顯示，灌胃給予100mg/kg的白藜蘆醇可有效抑制小鼠體內結腸癌細胞的轉移。前期體外實驗發現，20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res可協同抑制HepG2內NF-κB的激活，有效誘導細胞凋亡，展現優異的協同抗肝癌的作用。但其體內聯用是否具有同樣的藥效，通過何種機制起效及是否同樣存在協同作用，有待進一步考證。因此，本研究選取體內具有抗癌活性的木犀草素和白藜蘆醇給藥劑量，探討Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)的體內抗癌活性及機制。與體外研究結果一致，Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)可協同抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的生長且效果優于陽性對照藥(Sorafenib)。與體外機制研究相似，這種抗癌作用與抑制NF-κB的激活密切相關，抑制腫瘤細胞內NF-κB的激活，進而誘導凋亡相關蛋白的表達，介導了這種抗癌作用。但木犀草素聯合白藜蘆醇通過何種方式和途徑協同抑制NF-κB的激活，有待進一步研究。

白藜蘆醇是一種天然的，被公認的Sirt1激動劑。研究發現，Sirt1與NF-κB間存在調節關系，激活的Sirt1可作用于NF-κB的p65亞單位，使其Lys310的乙?；浇档?，進而抑制其轉錄活性[18,19]，發揮負向調節的作用，即激活的Sirt1可通過抑制NF-κB的轉錄活性。因此，我們推測白藜蘆醇可通過激活腫瘤細胞內的Sirt1，進而抑制NF-κB核轉錄活性。Ma等[20]研究發現，木犀草素也存在潛在的Sirt1激動活性，并可通過激活Sirt1誘導人非小細胞肺癌細胞的凋亡。除此之外，木犀草素對IKKβ/IκBα/NF-κB炎癥信號通路也有負向調節的作用，并展現出較好的血管炎癥作用[21]。因此，木犀草素可能是可通過激活Sirt1和抑制IKKβ/IκBα/NF-κB雙向協同抑制NF-κB的激活。綜上，我們推測，木犀草素和白藜蘆醇聯用可能通過聯合激活Sirt1和抑制IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路，進而雙重抑制瘤細胞內NF-κB的激活，發揮協同抗肝癌的作用，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，木犀草素(50 mg/kg)和白藜蘆醇(100 mg/kg)聯用較單獨治療具有更好的體內抗肝癌效果，其作用甚至優于陽性對照藥(Sorafenib)。機制研究顯示，這種協同抗肝癌作用與抑制腫瘤細胞內NF-κB的激活，促進肝癌細胞凋亡(抗凋亡蛋白Bcl-2下調，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3上調)密切相關。同時，鑒于木犀草素和白藜蘆醇的安全性高、自然界含量豐富等優勢，這種聯合治療方式也展現出良好的臨床治療和應用前景。