茯苓多糖對(duì)乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷的輔助保護(hù)作用

潘世杰，丁麗婷，胡婕倫，鐘亞東，黃鉆元，趙明姣，方芳，聶少平，鐘虹光，堯梅香，謝明勇*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西 南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西 九江 330000）

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在中國(guó)，胃病發(fā)生率高達(dá)85%，其中胃癌居我國(guó)城市男女高發(fā)癌癥的前5位，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。

胃病發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要表現(xiàn)就是胃黏膜損傷，其主要誘因包括酸堿平衡失調(diào)、胃幽門螺旋桿菌侵襲和胃腸黏膜的化學(xué)性損傷[2]，可歸結(jié)為胃黏膜的防護(hù)因子及攻擊因子失衡，造成胃黏膜內(nèi)的防護(hù)因子弱于攻擊因子，進(jìn)而產(chǎn)生胃黏膜損傷[3]。到目前為止，研究人員已開發(fā)出了胃酸中和藥、H2受體拮抗劑、H+泵抑制劑等用于臨床，使胃黏膜損傷性疾病的治療取得了一定進(jìn)展。但是，抗酸藥仍存在許多亟待解決的問題，如治療時(shí)間長(zhǎng)、潰瘍愈合遲緩、復(fù)發(fā)率高、副作用多等[4]。因此，人們一直在尋找其它替代藥物。

多糖是廣泛存在于自然界的生物大分子，與蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)共同構(gòu)成了最基本的生命物質(zhì)[5]，與人類生活密切相關(guān)，對(duì)維持生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。除此之外，多糖還被證實(shí)具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)[6-9]、抗氧化[10-13]、抗腫瘤[13-14]、胃腸道保護(hù)[15-17]、降血糖[18-20]、抗炎[21-22]等。如果能夠通過多糖來輔助治療胃腸道疾病，不僅可對(duì)醫(yī)藥和食品行業(yè)發(fā)展起到積極作用，也將對(duì)人類健康作出有利貢獻(xiàn)。

茯苓是中醫(yī)里廣泛使用的傳統(tǒng)“藥食同源”食材，具有滲濕利水、益脾和胃、寧心安神的功效[23]，許多經(jīng)典養(yǎng)胃健脾方劑中都有茯苓的身影。多糖作為茯苓的主要活性成分，已被證實(shí)具有抗腫瘤[24]和提高免疫力[25-26]等作用，但其在胃保護(hù)方面的作用鮮有報(bào)道。本文通過建立乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷模型[27]，探究茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）對(duì)胃黏膜損傷的輔助保護(hù)作用，并為PCP保護(hù)胃黏膜損傷的機(jī)制研究提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓原料：江中食療科技有限公司。西咪替丁：美國(guó)Sigma公司；小鼠白細(xì)胞介素-10（interlrukin-10，IL-10）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胃蛋白酶活性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER TOLEDO XS105電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器公司；JJ-12J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司；KD-P組織攤片機(jī)：金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；RM2016病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；3K15高速臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；3001全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（多功能酶標(biāo)儀）：美國(guó)Thermo公司；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；LAQUAtwin-Ph-33微量PH計(jì)：日本HORIBA公司；KZ-II組織破碎儀：武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)5周齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量32 g～38 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)過程中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守南昌大學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例，倫理委員會(huì)鑒定許可。實(shí)驗(yàn)墊料、飼料經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。

1.4 方法

1.4.1 茯苓多糖的提取與制備

茯苓粉用5倍體積95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良后的熱水浸提結(jié)合酶輔助醇沉法提取PCP[28]。將提取液旋蒸濃縮至原體積1/5，采用Sevage法脫蛋白，之后依次用自來水流水透析2 d，蒸餾水透析1 d，再旋蒸濃縮，倒平板凍干即得茯苓多糖。

1.4.2 乙醇致胃黏膜損傷動(dòng)物模型的建立

將60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、西咪替丁組和PCP低、中、高劑量組，每組10只。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，開始正式實(shí)驗(yàn)后，每天稱重并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量（0.1 mL/10 g）。PCP每天灌胃劑量：低劑量組0.05 g/kg bw、中劑量組0.1 g/kg bw、高劑量組0.2 g/kg bw，正常組、模型組、西咪替丁組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水。持續(xù)灌胃12 d。第13天，西咪替丁組按1 mg/10 g bw灌胃西咪替丁，其它組保持不變，持續(xù)3 d。第16天造模前，各組小鼠均嚴(yán)格禁食不禁水12 h，期間亦禁止給予受試物。正式造模當(dāng)天，各組均繼續(xù)灌胃對(duì)應(yīng)受試物，1 h后，正常組按0.1 mL/10 g給予生理鹽水，其余組均按0.1 mL/10 g給予70%乙醇，70 min后處死。

1.4.3 臟器指數(shù)的測(cè)定

正式造模當(dāng)天稱量并記錄體重后，處死，取臟器（肝臟、腎臟、脾臟、胸腺）并用生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重記錄，用于計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/（mg/g）=器官質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）

1.4.4 胃液pH值的測(cè)定

小鼠處死后，剪開腹部取出胃，沿胃大彎剪開，小心取出內(nèi)容物后，在（25±2）℃條件下，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，用微量pH計(jì)測(cè)出小鼠胃液pH值。

1.4.5 直觀胃黏膜損傷情況觀察及胃黏膜損傷指數(shù)的測(cè)定

小鼠處死后，剪開腹部取出胃，沿胃大彎剪開，洗凈殘留內(nèi)容物后展開固定，拍照記錄。肉眼觀察并記錄褶皺和出血點(diǎn)個(gè)數(shù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量損傷條帶的長(zhǎng)度和寬度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[29]。

表1 胃黏膜損傷指數(shù)評(píng)分Table 1 Gastric mucosal injury index score

胃黏膜損傷指數(shù)=出血點(diǎn)分?jǐn)?shù)+糜爛長(zhǎng)度分?jǐn)?shù)+糜爛寬度分?jǐn)?shù)×2

1.4.6 胃組織病理觀察

選取每只小鼠胃黏膜損傷最嚴(yán)重部位，切下約10 mm×2 mm的組織，固定于4%福爾馬林溶液中，常規(guī)梯度脫水、包埋、切片、烤片，HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.7 胃組織勻漿液制備

將胃沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物并展開胃黏膜。將胃組織與磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）按體積比 1∶9 混合，加入 4 mm 研磨珠，用組織破碎儀進(jìn)行破碎，制得10%胃組織勻漿。將勻漿液以3 500 r/min在4℃下離心10 min，取上清液，得組織勻漿上清液，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.8 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性測(cè)定

參照試劑盒說明書，測(cè)定胃組織勻漿上清液中的IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graph-Pad Prism 8軟件作圖；采用單因素ANOVA分析和Tukey′s多因素t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。p＜0.05時(shí)，表示組間具有顯著差異；p＜0.01時(shí)，表示具有極顯著差異；0.05＜p＜0.1時(shí)，表示與正常組相比傾向于具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 伏苓多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

各組小鼠臟器指數(shù)見表2。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)Table 2 Organ index of mice in each group

如表2所示，各實(shí)驗(yàn)組之間肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均無顯著性差異，但模型組肝臟指數(shù)與正常組相比傾向于具有顯著差異。說明乙醇致胃黏膜損傷模型對(duì)小鼠的其它臟器無明顯損傷，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下茯苓多糖及西咪替丁對(duì)小鼠無顯著毒副作用。

2.2 胃黏膜表觀

各組胃黏膜直觀圖見圖1。

圖1 各組胃黏膜直觀圖Fig.1 The direct view of gastric mucosa in each group

由圖1可知，正常組小鼠胃黏膜完整，形態(tài)和色澤正常，未見出血、潰瘍、糜爛等異常情況；模型組小鼠胃黏膜有明顯的出血、潰瘍和糜爛，可見粗大的出血條帶及大量的出血點(diǎn)，表明乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷模型造模成功；西咪替丁組小鼠胃黏膜有少量出血點(diǎn)，未見潰瘍、糜爛等情況，說明西咪替丁能有效防止胃黏膜損傷；PCP低、中、高劑量組均有少量出血點(diǎn)，未見潰瘍、糜爛等情況，說明PCP能有效防止胃黏膜損傷。

2.3 伏苓多糖對(duì)胃液pH值的影響及損傷評(píng)價(jià)

胃液pH值及胃黏膜損傷評(píng)價(jià)見圖2。

圖2 胃液pH值及胃黏膜損傷評(píng)價(jià)Fig.2 PH of gastric juice and evaluation chart of gastric mucosal injury in each group

由圖2A可知，模型組胃液pH值極顯著高于正常組（p＜0.01），西咪替丁是胃酸抑制劑，故西咪替丁組胃液pH值與正常組和模型組差異極顯著。PCP低劑量組與模型組相比未能降低胃液pH值，而PCP中、PCP高劑量組相比模型組pH值均顯著降低，且數(shù)值與正常組無顯著差異。

由圖2B可知，模型組損傷評(píng)分極顯著高于其它組，說明乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷造模成功。其余各給藥組相比模型組損傷評(píng)分均有極顯著下降，其中PCP高劑量組評(píng)分最低，且與正常組無顯著差異，之后依次為西咪替丁組、PCP中劑量組和PCP低劑量組。

2.4 胃組織病理學(xué)觀察

各組胃組織病理學(xué)觀察圖見圖3。

圖3 各組胃組織病理學(xué)觀察圖（×200 μm）Fig.3 Histopathological observation of stomach in each group（×200 μm）

如圖3所示，正常組小鼠胃組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、水腫及充血現(xiàn)象。與正常組相比，模型組小鼠胃組織腺體結(jié)構(gòu)紊亂，胃黏膜嚴(yán)重充血，上皮細(xì)胞大量脫落，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，西咪替丁組和PCP低、中、高劑量組胃黏膜損傷狀態(tài)均有明顯改善，胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、胃黏膜充血及腺體結(jié)構(gòu)紊亂情況有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。由此可知，西咪替丁和PCP低、中、高劑量都對(duì)胃黏膜損傷有輔助保護(hù)作用。

2.5 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果

胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性見圖4。

圖4 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性變化Fig.4 The content of IL-10、LPS and the activity change of pepsin in gastric tissue

由圖4可知，模型組IL-10含量極顯著低于正常組，PCP低劑量組與模型組有顯著差異，其余各給藥組與模型組相比均無明顯差異；模型組LPS含量極顯著高于正常組，各給藥組均較模型組有一定降低，其中西咪替丁組和PCP低、中劑量組與模型組相比有極顯著差異，PCP高劑量組與模型組相比無明顯差異；模型組胃蛋白酶活性與正常組相比有極顯著差異，各給藥組相對(duì)模型組均有極顯著改善。

3 結(jié)論

飲酒伴隨著中國(guó)傳統(tǒng)文化傳承多年，形成了中國(guó)特有的“酒文化”，但酒精會(huì)對(duì)人體造成傷害。本文通過臟器指數(shù)數(shù)據(jù)可知，短時(shí)間乙醇暴露雖未對(duì)其它臟器造成不利影響，但肝臟指數(shù)有增大的趨勢(shì)，因此在傳承“酒文化”的同時(shí)降低酒精對(duì)人的傷害成了近年來熱門的研究方向。茯苓作為常見的“藥食同源”食材，有很大的利用前景和發(fā)展空間。本實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)結(jié)果表明，茯苓多糖可以恢復(fù)胃正常狀態(tài)下的產(chǎn)酸能力，同時(shí)通過降低胃蛋白酶活性以及減少胃組織中脂多糖含量起到對(duì)胃黏膜的輔助保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論可為以茯苓多糖為原料的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。值得注意的是，茯苓多糖對(duì)胃黏膜損傷具體的保護(hù)機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探討。