3種百香果果實糖含量與糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的分析

王宇，王紅林，方曉彤，穆波，曾帆，馬玉華，周俊良

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550005）

百香果（Passiflora edulia Sims），學(xué)名西番蓮，別名雞蛋果、巴西果[1]，多數(shù)栽培種為紫果、黃果以及紫果與黃果雜交種。因其具有多種水果香氣，風(fēng)味濃郁且果實多汁，又被稱為“果汁之王”[2]。貴州省地區(qū)自然氣候條件優(yōu)越，在南北盤江、紅水河、都柳江流域等低熱河谷地區(qū)，適合百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。百香果自2016年引入貴州種植后[3]，種植面積已經(jīng)從最初的零星種植快速發(fā)展至15萬畝，為吸引消費者、滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求、提升市場競爭力，選育風(fēng)味足、口感佳的百香果品種將是今后百香果育種的重要方向。

消費者普遍認(rèn)為甜度和香味是水果最重要的品質(zhì)[4]。水果中存在多種物質(zhì)可以對果實風(fēng)味及品質(zhì)產(chǎn)生影響，已經(jīng)報道的有糖、酸、類胡蘿卜素及芳香類物質(zhì)等[5-8]。在柑橘、番石榴、荔枝等水果中，糖種類及含量差異直接影響果實甜度及風(fēng)味[9-11]。糖類物質(zhì)可占植物干重的85%～90%，糖含量分析是研究植物糖代謝的基礎(chǔ)[12]。作為貴州大力發(fā)展的熱帶水果，目前關(guān)于百香果糖組分及含量雖有部分研究，但不夠全面；特別是貴州地區(qū)主要栽培的3個百香果品種，尚未針對其開展系統(tǒng)的糖組分及含量與糖代謝相關(guān)基因表達(dá)差異研究。

本研究以貴州地區(qū)3個不同品種百香果為試材，通過氣相色譜-質(zhì)譜分析（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對成熟期果實糖種類及含量進(jìn)行檢測，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘影響百香果果實糖含量變化的關(guān)鍵調(diào)控基因，并對其進(jìn)行表達(dá)量分析。從生理指標(biāo)和分子水平探討影響百香果糖含量變化的機制，以期為糖組分差異對果實品質(zhì)及風(fēng)味影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料取自貴州省果樹科學(xué)研究所鎮(zhèn)寧熱帶亞熱帶果樹科研示范基地（以下簡稱基地），以基地栽培種植的紫香百香果、黃金百香果、滿天星百香果為試驗材料，每個品種分別選取3株進(jìn)行采樣，果汁分別混勻后液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

RNAiso Plus RNA提取試劑盒、Fruit-mate for RNA purification RNA多糖去除劑、5×Reversse Transcriptase M-MLV-Buffe、M-MLV Reversse Transcriptase M-MLV Rnase、Reconbinent RNase Inhibitor、dNTP Mixture：寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green PCR Master Mix核酸染色劑、冰醋酸、瓊脂糖（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；異丙醇（分析純）、75%乙醇（分析純）、雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺[bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA]（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯仿（分析純）：天津市外環(huán)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyH酶標(biāo)儀：美國BioTeK公司；H1-16KR型高速冷凍離心機：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；ST3100 pH計：北京中創(chuàng)先鋒科技有限公司；Eppendorf移液槍：德國Eppendorf公司；FA2004精密天平：天津天馬衡基儀器有限公司；DW-HL398S超低溫冷凍儲存冰箱：上海始恒儀器設(shè)備有限公司；Mill-Q超純水制備儀：美國Millipore公司；DGL-75B高壓滅菌鍋：江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司；8401-1高溫烘箱：上海喆肽機械制造有限公司；GZX-9146MBE鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；IMS-70碎冰機：河南天馳儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州天啟動凈化科技有限公司；CR21GII型超高速冷凍離心機：日本Hitachi公司；ASP-3700微量核酸檢測分光光度計：美國ACTGene公司；熒光定量PCR儀：美國Bio-Rad公司；iCycler質(zhì)譜儀、NanoLC-1DTM液相色譜儀：美國AB SCIEX公司；ClarityTM Western ECL Substrate電泳凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 糖組分及含量測定

利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）法對3個品種百香果的糖組分及含量進(jìn)行測定。稱取20 mg經(jīng)真空冷凍干燥的樣品粉末，加入500 μL甲醇∶異丙醇∶水（3∶3∶2，體積比）提取液，渦旋 3 min，冰水中超聲30 min；4℃、14 000 r/min離心 3 min，吸取 50 μL 上清液，加入20 μL核糖醇內(nèi)標(biāo)，氮吹并凍干機凍干；加入100 μL 甲氧銨鹽吡啶（15 mg/mL），37℃孵育 2 h，隨后加入BSTFA 100 μL，37℃孵育30 min，得到衍生化溶液，正己烷稀釋，保存于棕色進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS分析。

色譜質(zhì)譜采集條件：進(jìn)樣量 3 μL；分流比 3∶1；載氣為He氣；色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱流速為1 mL/min；柱箱升溫程序為170℃保持2 min，10℃/min升至240℃，5℃/min升至280℃，25℃/min升至310℃，310℃保持4 min；傳輸線溫度240℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電離電壓70 eV；掃描模式，選擇性離子檢測（selected ion monitor，SIM）；溶劑延遲 3.5 min。

1.3.2 基因表達(dá)分析

利用RNAiso Plus RNA提取試劑盒對果實總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）進(jìn)行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物，并純化回收，使用Illumina Hiseq 2000基因測序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3.3 實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出與百香果糖代謝相關(guān)的基因：磷酸果糖激酶（phospho fructose kinase，PFK）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxylation kinase，PEPCK）、丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC），以翻譯起始因子為內(nèi)參基因，利用Primer Express 5.0軟件設(shè)計用于基因表達(dá)定量分析的引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成），引物信息見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR

以試驗得到的百香果互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）為模板，采用熒光定量PCR儀對百香果糖代謝基因進(jìn)行實時定量分析，同時做3個生物學(xué)重復(fù)。最后建立擴增動力學(xué)曲線和熔解曲線分析，反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)設(shè)置程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 15 s，35個循環(huán)。重復(fù)測定3次。

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系Table 2 RT-qPCR reaction system

PCR結(jié)束后自動分析熔解曲線，最后根據(jù)熔解曲線獲得的循環(huán)閾值（cyle threshold，CT），通過 2-ΔΔCT的方法計算各基因的相對表達(dá)量。

1.4 糖含量計算

利用Agilent MassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并完成糖含量定性定量分析。按下列公式計算實際樣本中糖含量。

式中：c為樣本中積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值，μg/mL；V1為定容所用溶液的體積，μL；V2為樣品提取過程中加入樣本提取液的體積，μL；V3為樣品提取過程中收集上清液的體積，μL；m為稱取的樣本質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性定量分析

采用Agilent MassHunter軟件進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果顯示13種糖質(zhì)譜信息均獲得采集。

2.2 質(zhì)量控制分析

通過對同一質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本進(jìn)行分析，根據(jù)保留時間和峰強度確定此項目檢測期間儀器穩(wěn)定，結(jié)果真實可信。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

線性方程見表3。

表3 線性方程Table 3 Linear equation

2.4 糖含量分析

將各個糖積分峰面積代入表3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，進(jìn)一步帶入1.4中糖含量公式計算后，得到3個不同品種百香果果實糖絕對含量數(shù)據(jù)見表4。

表4 百香果果實糖含量Table 4 Sugar content of passion fruit mg/g

如表4所示，3個不同品種百香果糖含量最高的是葡萄糖，其次是D-果糖，蔗糖含量居第3位，其余糖組分含量較低，且木糖醇含量在檢測限下。

2.5 關(guān)鍵基因表達(dá)量分析

磷酸果糖激酶的活性可以兼?zhèn)淇焖僬{(diào)節(jié)與遲緩調(diào)節(jié)，催化物質(zhì)及能量代謝過程中酶的活性，協(xié)調(diào)、調(diào)控糖酵解代謝途徑[13]；丙酮酸脫羧酶可作用于丙酮酸形成CO2和乙醛；磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶在三羧酸循環(huán)中催化逆反應(yīng)，以回補草酰乙酸。選取測序得到的翻譯起始因子作為內(nèi)參基因，對紫香、黃金、滿天星中3個糖代謝相關(guān)基因（PFK、PEPCK、PDC）進(jìn)行表達(dá)分析，其表達(dá)情況見圖1～圖3。

圖1 紫香與滿天星糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.1 Analysis of gene expression related to glucose metabolism of sugar level in Purple and Mantianxing

圖2 黃金與滿天星糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.2 Analysis of gene expression related to glucose metabolism of sugar level in Gold and Mantianxing

圖3 紫香與黃金糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.3 Analysis of gene expression related to glucose metabolism of sugar level in Purple and Gold

圖1結(jié)果顯示，與滿天星相比，紫香的磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸脫羧酶（PDC）基因表達(dá)量差異不顯著，而磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（PEPCK）基因表達(dá)量差異顯著，為上調(diào)表達(dá)。于麗等[14]研究表明，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶可催化由磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的反應(yīng)，且催化反應(yīng)伴有腺嘌呤核苷三磷酸的生成，其更有利于有機體生長和產(chǎn)酸。因此，紫香的產(chǎn)酸能力大于滿天星，這也是紫香口感偏酸的原因。

圖2結(jié)果顯示，與滿天星相比，黃金的磷酸果糖激酶（PFK）表達(dá)量差異不顯著；丙酮酸脫羧酶（PDC）基因表達(dá)量差異極顯著，為下調(diào)表達(dá)，而磷酸烯酶丙酮酸羥化激酶（PEPCK）基因表達(dá)量差異顯著，為上調(diào)表達(dá)。丙酮酸脫羧酶在代謝中對乙醇的含量有抑制作用，從而增加糖含量[16]。因此黃金的糖含量大于滿天星。

圖3結(jié)果顯示，與黃金相比，紫香的磷酸果糖激酶（PFK）和磷酸烯醇丙酮酸羥化激酶（PEPCK）兩個基因表達(dá)量差異不顯著，而丙酮酸脫羧酶（PDC）基因表達(dá)量差異顯著，為上調(diào)表達(dá)。李盼盼[17]研究表明，丙酮酸脫羧酶的表達(dá)與“布魯諾獼猴桃”貯藏期的乙醇含量有關(guān)，從而影響獼猴桃糖含量的積累，故紫香糖含量小于黃金。

3 討論與結(jié)論

可溶性糖不僅對果實的甜味品質(zhì)起到?jīng)Q定作用[18]，還可作為生命活動的能源物質(zhì)與調(diào)控代謝的信號物質(zhì)[19-20]。作為生命體的基本組成部分和重要能量來源，糖還參與了細(xì)胞識別、代謝調(diào)節(jié)、形態(tài)發(fā)育、免疫保護(hù)、衰老癌變等眾多的生命活動，糖分析是研究其在生命體轉(zhuǎn)化和生理作用的前提和重要手段。

檢測結(jié)果表明，在常見的13種可溶性糖中，以葡萄糖含量最高，果糖次之，蔗糖居第3位。由于不同品種間，糖代謝的調(diào)控機制存在顯著差異，因此決定了果實風(fēng)味的糖含量也存在明顯差異[13]。經(jīng)檢測，黃金百香果在葡萄糖、D-果糖、蔗糖的含量均明顯高于紫香和滿天星，而紫香的蔗糖含量明顯高于滿天星，但在葡萄糖與D-果糖含量上略顯不足。

通過色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定3個品種百香果的糖含量，D-果糖與葡萄糖含量由高到低依次為黃金、滿天星、紫香。通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶與丙酮酸脫羧酶的兩個基因在不同品種間表達(dá)量存在顯著差異，且與GC-MS法測定3個品種百香果的糖含量變化趨勢一致，因此推測這兩個基因在百香果糖代謝中起重要作用。