品質異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的分離鑒定

陳薈旭，潘姣姣，桂成坤，孫鵬亮，張秋林，魏鑫豪，李蓮瑞

（1.塔里木大學 動物科學學院，新疆 阿拉爾843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾843300；3.新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾843300）

0 引言

芽胞桿菌是一類好氧或兼性厭氧[1-2]、能產生內生胞子并具有繁殖快速、生命力極強等特性的革蘭陽性菌。該菌廣泛分布于土壤、水、空氣、動物腸道和植物體內[3-5]。如今乳制品受到廣大消費者的青睞，國家對其質量安全要求更高，牛乳在嚴格的加工流程中經殺菌處理后，有些耐熱性芽胞仍可能殘留于乳中或在其它生產環節被芽胞桿菌污染，受到污染的乳制品被消費者食用后嚴重的可能危及生命。根據各國的研究調查表明，污染乳制品的細菌大多都是芽胞桿菌。生慶海[6]等研究了滅菌乳中芽胞桿菌產酶與乳品質的關系，發現了芽胞桿菌的酶能水解乳蛋白，產生蛋白變性，使酸度提高、產生沉淀等。陳霞[7]等人研究了耐熱芽胞桿菌的最適生長溫度，并對芽胞桿菌經過不同溫度熱處理后的活性進行了研究。本實驗擬從品質異常的全脂滅菌乳中分離芽胞桿菌，并對其進行一些研究和分析，希望找到污染此類乳制品的芽胞桿菌。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

異常全脂滅菌乳（異常現象為：味道微苦，有蛋白凝集、沉淀，微有漲袋），由南疆某乳品企業提供，取回后4℃保存備用，用于分離異常全脂滅菌乳中的芽胞桿菌。

1.2 試驗藥品

氯化鈉，氫氧化鈉，無水乙醇，結晶紫，草酸銨，碘，碘化鉀，丙酮，番紅，孔雀石綠，蛋白胨，酵母粉，瓊脂，瓊脂糖，核酸染料，溶菌酶，甘油，錳鹽營養瓊脂，普通營養瓊脂，嗜冷菌計數瓊脂，DNA maker，氨芐青霉素（Ampicillin Na）。

1.3 試劑和儀器

95%乙醇溶液，結晶紫溶液，碘液，0.5%的番紅乙醇溶液，1%氫氧化鈉溶液，飽和孔雀綠溶液，無菌水。恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；高壓鍋，日本TOMY KOGYO公司；小型臺式高速離心機，Eppendorf公司；小型高速冷凍離心機，Eppendorf公司；微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司；潔凈工作臺，上海博訊實業有限公司；顯微鏡，日本尼康株式會社；微量移液器，Thermo科技有限公司；水浴鍋，上海博訊實業有限公司；搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；加熱制冷循環器，德國JULABO Laborteckmik G mbh。

2 實驗方法

2.1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、純化

取樣：袋裝全脂滅菌乳（利樂包），潔凈工作臺內無菌操作將乳樣分裝到無菌250 mL錐形瓶中100 mL。

接種：將取出乳樣80℃水浴20 min，水浴后用無菌蒸餾水倍比稀釋5個梯度，涂布法分別接種于錳鹽營養瓊脂55℃培養和普通營養瓊脂37℃培養24～48 h，嗜冷菌計數瓊脂5℃培養5～7 d，倒置于恒溫培養箱培養。

純培養：觀察培養的細菌形態，選取單菌落于不同培養基上劃線培養。

對純培養的細菌進行制片，革蘭染色和芽胞染色和鏡檢，篩選：選取單菌落中有芽胞的菌體，接種于裝有8 mL液體培養基的細菌瓶中搖菌擴增，用于DNA提取。

2.2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌DNA的提取

取擴菌后的細菌1 mL于1.5 mL的無菌離心管內，12000 rpm離心1 min，棄上清，重復一次，收集適量細菌。細菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術有限公司DNA提取試劑盒（M 10208）說明書進行操作。提取的DNA于-20℃保存備用。

2.3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌16S rDNA克隆的質粒鑒定

2.3.1 對PCR產物切膠回收

按照北京全式金生物技術有限公司膠回收試劑盒（L41118）說明書進行操作，回收的DNA于-20℃保存備用。

2.3.2 目的基因與連接T載體

回收的PCR產物連接到p MD-19T載體上，于加熱制冷循環器16℃連接過夜。連接反應體系反應液組分16SrDNA片段0.5μL、p MD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。

2.3.3 轉化克隆和菌液PCR鑒定

將連接物7μL加入到100μL感受態細胞DH 5α中，冰浴30 min，42℃熱沖擊90 s，再置于冰中1 min，加入含Amp+（50μg/m L）的LB液體培養基900μL，37℃，200 rpm振蕩培養1 h，取轉化菌100μL使用涂菌珠涂布于含有Amp+（50μg/mL）的瓊脂平板培養基上，培養12 h，培養出細菌后，挑取單菌落，于含Amp+（50μg/m L）的LB液體培養基中過夜培養，用菌液做PCR（細菌通用引物序列如下：27F：5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-CGGTACCTTGTTACGACTT-3'進行PCR擴增。PCR擴增體系為：DNA模擬1μL；上游引物和下游引物各0.5μL；EasyTaq SuperMix12.5μL，加入dd H2O補至25μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s；72℃延伸90 s；35個循環；72℃再延伸10 min。PCR產物徑1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察是否有目的條帶。擴增芽胞桿菌16s rDNA的序列），1%瓊脂糖電泳后，觀察條帶大小。

2.3.4 提取質粒與質粒電泳鑒定

提取質粒按照天根生化科技有限公司的高純度質粒小提試劑盒說明書進行操作。取20μL質粒與p MD-19T Vector自連，經1%瓊脂糖電泳后，察看電泳條帶大小。

2.3.5 測序

對于菌液PCR結果為陽性的克隆細菌，提取其質粒，送測序。

2.3.6 序列分析

將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，判定該芽胞桿菌的種屬。

3 結果與分析

3.1 品質異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、純化結果

將異常酸牛乳樣于80℃水浴20 min，水浴后分離得到單菌落，經革蘭染色，初步鑒定為芽胞桿菌后，將細菌純化后培養結果見圖1。菌落形態：菌落小，淡黃色，圓形，隆突，有光澤，半透明。

圖1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌

3.2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的染色結果

異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌D革蘭染色結果見圖2。

圖2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌革蘭染色1000×

異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌D經過芽胞染色以后，結果見圖3。

圖3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌芽胞染色1000×

3.3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的基因組提取結果

將液體培養基中過夜培養的芽胞桿菌D，使用全式金DNA提取試劑盒（M 10208）提取DNA后，經1%瓊脂糖電泳后，結果如圖4。由圖可以看出，芽胞桿菌D的基因組提取成功。

圖4 細菌基因組的電泳結果

3.4 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的的16S rDNA擴增結果

提取芽胞桿菌D基因組DNA，用細菌通用引物16SrDNA對其擴增，PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。

由圖可以看出，使用細菌16S rDNA通用引物序列擴增出了芽胞桿菌D的16S rDNA基因大小約為1500 bp，與預期大小相符。

3.5 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的16S rDNA克隆質粒的鑒定結果

將16S rDNA片段和p MD-19T Vector連接產物轉化到大腸桿菌DH 5a，涂布于含有Amp+（50μg/mL）的瓊脂平板培養基上，培養12 h，培養出細菌后，挑取單菌落，于含Amp+（50μg/mL）的LB液體培養基中過夜培養，提取大腸桿菌的質粒，經1%瓊脂糖電泳，PMD-19T Vector自連為對照，結果如圖6。

圖6 16SrDNA克隆質粒的鑒定結果

由圖可看出，克隆出的16S rDNA基因大小為1500 bp左右，與篩選出的芽胞桿菌的16S rDNA基因大小相同，該陽性克隆可送測序。

3.6 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的16S rDNA的測序結果

細菌D的序列如下：

3.7 序列分析結果

將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，判定該芽胞桿菌的種屬，比對結果見表1。

表1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌序列比對結果

3.8 短小芽胞桿菌系統發育樹的構建及分類

將其結果提交到NCBI數據庫進行核酸比對，建立進化樹后分析表明，該菌株與登錄號為KR 780437、KU 662344、KU 662334、MT 052639、KU 681229、JN 578480、MN 704393的短小芽胞桿菌處于同一分支，且根據同源性分析，該菌株與登錄號為KR 780437、KU 681229、MN 704393、JN 578480的短小芽胞桿菌的同源性為100%，根據以上結果，可以確定該菌株為短小芽胞桿菌。進化樹分析結果和同源性比較如下，見圖7～8。

圖7 短小芽胞桿菌進化樹

圖8 同源性分析

4 討 論

芽胞桿菌在惡劣環境條件下，脫水形成休眠體芽胞。芽胞的結構復雜，最里面為核芯，含原生質體，被芽孢膜所包裹。由于芽孢的多層結構，其對熱、干燥和其他理化因素具有較強的抗性，滅殺的要求更苛刻。因此乳制品生產過程中,可能存在芽胞桿菌經熱處理后沒有被殺死,隨生產流程進入管道，管道中乳制品營養較豐富,這些細菌形成生物膜包裹自身[8]，隨著生產線進入下一生產階段直至生物膜成熟后釋放包裹的芽胞桿菌污染整個乳制產品[9]。韓永霞[10]研究發現經過超高溫瞬時滅菌的制品中依然存在地衣芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等嗜熱芽胞桿菌的污染，王林林[11]以5種不同品牌的瞬時高溫滅菌牛奶為研究樣本，從中分離鑒定出短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌等。短小芽胞桿菌能代謝產生堿性蛋白酶、脂肪酶和膠原蛋白酶等，在牛奶營養瓊脂上形成透明的水解圈，是一種能引起食源性疾病的腐敗菌[12]，劉潤身[13]在乳品污染水中分離出蛋白降解菌，鑒定為短小芽胞桿菌，該菌對乳品的危害較大，卻未見有該菌引起食物中毒報道，可能是該菌污染食品的幾率小。本實驗在滅菌乳中檢測出短小芽胞桿菌，卻未見原料乳中存在，說明該菌是在UHT殺菌后污染進入乳品中的，可能存在該菌的環節是冷卻和灌裝環節。康博燕[14]調查了乳品生產環境中微生物，短小芽胞桿菌存在于乳品加工車間的灌裝間和外包裝車間。控制該芽胞桿菌的污染乳制品，應提高乳品加工車間及生產設備的清洗消毒程度。本實驗從異常全脂滅菌乳中分離鑒定出了短小芽胞桿菌。

5 結 論

本實驗通過對異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、培養、純化，經16SrDNA鑒定出異常全脂滅菌乳中存在嗜熱菌：短小芽胞桿菌，該乳品受短小桿菌污染。