不同脂肪處理純化方法對移植脂肪組織的影響

陳兵 李發成

自體脂肪移植，手術操作簡單，創傷小，恢復快，效果好，并且組織來源充足，無排斥反應，因而被廣泛應用于修復各類軟組織缺損以及美容外科領域，尤其在乳房外科中的應用愈發得到整形外科的重視和認可［1］。然而，在臨床應用中，特別是大體積脂肪移植時，移植脂肪存在較高的吸收率和壞死率，體積保留率僅為50%～70%［2－3］。因此，提高移植后的脂肪組織成活率一直是自體脂肪移植領域的研究重點。

為了促進移植脂肪存活再生，提高脂肪移植效率，通過添加外源性促成脂、促血管化刺激來輔助脂肪移植，在一定程度上有效提高了脂肪移植存活率，已應用的方法包括細胞輔助脂肪移植技術（CAL）［4－5］、添加富血小板血漿（PRP）［6－7］、脂肪源干細胞基質膠（SVF－gel）［8－9］以及脂肪脫細胞提取液［10］等。自體脂肪移植術后的效果，還取決于術中的操作和處理，包括脂肪的抽吸、處理純化以及注射技術等。其中，脂肪的處理純化方法是影響脂肪移植成活率的主要因素之一，處理純化后的脂肪組織應含盡量少的水、油脂顆粒、血液來源細胞以及細胞碎片，盡可能保持脂肪細胞的完整性，且富含脂肪干細胞。因此，優化脂肪的處理純化技術，提高脂肪移植效率是臨床一直關注和致力于解決的問題。

目前，脂肪的處理純化方法主要有靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法與過濾濃縮法等。靜置沉淀與清洗沉淀法操作簡單、對組織破壞小，但濃縮效率偏低；離心法是應用最廣泛的脂肪濃縮處理方法，但爭議也較大。Kurita 等［11］認為，離心法能較大程度地濃縮脂肪組織，提高單位體積移植物中脂肪細胞數目與脂肪干細胞的比例。雷華等［12］則認為，無論是高速還是低速離心，脂肪顆粒的活性都會受損，建議慎用離心法處理純化脂肪顆粒。Conde－Green等［13］比較了靜置法、清洗法和離心法處理純化的脂肪組織中的細胞數量、細胞膜完整性以及脂肪干細胞數量，認為清洗法最大限度上保留了脂肪細胞活性以及內皮細胞和脂肪干細胞的數量。

為了對比不同的純化方法對移植脂肪的影響，本研究比較了靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法4 種臨床最常用的脂肪處理純化方法，體外觀察脂肪組織的細胞完整性、脂肪細胞活性、脂肪組織內水和油脂含量、SVF 細胞數量、脂肪干細胞含量等體外研究指標，并構建裸鼠脂肪移植模型進行體內驗證，為優化脂肪移植技術、提高脂肪移植后存活效率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

低糖DMEM 培養基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國），甘油－3－磷酸脫氫酶檢測試劑盒（Kamiya，美國），Perilipin A抗體（Abcam，美國），CD45、CD31、CD34、CD105 流式抗體（BD，美國）。

倒置相差顯微鏡（Olympus BX5，日本），Megaf Uge 離心機（Thermo Scientific，美國），AriaⅡ流式細胞儀（BD，美國），NanoDrop 2000c 微量分光光度計（Thermo Scientific，美國）。

1.2 脂肪組織的獲取

脂肪組織取自20 位接受脂肪抽吸手術的健康女性。所有獲取的脂肪組織隨機平均分為4 組，分別采用靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法進行純化處理，并用于后續實驗。本研究經我院醫學倫理委員會審核同意，所有患者均已簽署知情同意書。

1.3 實驗動物

BALD／c 裸鼠，6 周齡（中國軍事醫學科學院實驗動物中心），由我院研究中心動物室喂養管理。實驗過程中對動物的處置遵守科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定。

1.4 脂肪組織分組與處理純化

A 組，靜置沉淀組，脂肪放置在20 mL 的注射器中，注射器垂直靜置沉淀15 min。從上到下最終分為油脂層、脂肪組織層和液體層，去除上層油脂和底層液體層，保留中間脂肪組織用于后續實驗（圖1Aa）。

B 組，清洗沉淀組，脂肪經等體積生理鹽水清洗2 遍，放置在20 mL 的注射器中，靜置沉淀15 min，取中間層脂肪組織用于后續實驗（圖1Ab）。

C 組，離心組，脂肪放置在20 mL 的注射器中離心（1 200×g，3 min，4 ℃）。同樣取中間層脂肪組織用于后續實驗（圖1Ac）。

D 組，棉墊吸附濃縮組，抽吸的脂肪經生理鹽水清洗后倒入無菌棉墊，吸附濃縮去除水分和游離油脂（圖1Ad）。

1.5 脂肪組織含水量和游離油脂含量測定

取各組處理純化后的脂肪組織10 mL，分別放入15 mL 離心管中離心（1 200×g，3 min，4 ℃）。離心后，該組織成分按不同密度從上到下依次分為：游離油脂層、脂肪組織層和水液體層，分別測量游離油脂層、脂肪組織層和水液體層的體積占總體積的比例（圖1B）。

圖1 4 種純化方法處理后脂肪組織的含水量及油脂含量Fig.1 Water content and oil content of lipoaspirate processed by 4 purification methods

1.6 SVF 計數與亞群統計

取每組處理純化后的脂肪組織10 mL 置于50 mL離心管中，加入等體積含0.1% Ⅰ型膠原酶的DMEM 低糖培養基混合，置于37 ℃振蕩箱中消化60 min 后，去除上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 低糖培養基重懸底部沉淀物，吹打混勻后離心（1 200×g，5 min）。去上清后，底部沉淀物振蕩重懸于紅細胞裂解液中，室溫下放置5 min。沉淀物重懸于PBS 緩沖液，1 200×g離心5 min，該過程反復2 次。濾網過濾后，濃縮至1 mL 細胞懸液，移入1.5 mL的EP 管中，取細胞懸液10μL 進行有核細胞計數。

上述各組細胞定量后，將細胞懸液濃縮成每100μL 含1×106個有核細胞，分別移入1.5 mL 的EP 管中。各組SVF 細胞分別依次加入CD31、CD34、CD45、CD105 抗體，陽性、陰性對照組加入同型抗體，充分混合后避光冰浴30 min。用流式分析緩沖液清洗后，將上述細胞懸液濾網過濾入流式分析管，依次上機進行流式細胞分析。

1.7 脂肪細胞完整性和活性檢測

1.7.1 脂肪細胞結構觀察

各組脂肪組織用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE 和免疫組化染色。鏡下觀察并比較4 種不同純化方法處理的脂肪的組織學特點。HE染色用于觀察組織鏡下結構，脂周蛋白（Perilipin，PLIN）免疫組化染色用于觀察脂肪細胞結構完整性。

1.7.2 脂肪細胞代謝活性檢測

甘油－3－磷酸脫氫酶（G3PDH）活性可用于評估各組脂肪細胞活性，G3PDH 活性越高，移植物中脂肪細胞功能越好。參照使用說明書，應用G3PDH檢測試劑盒定量檢測G3PDH 活性，并根據公式G3PDH 活性（U／mL）＝ΔOD×0.482×20 計算脂肪組織細胞內G3PDH 活性值。

1.8 動物試驗

6 周齡BALD／c 裸鼠共60 只，分3 次進行脂肪組織移植，每次20 只裸鼠，按靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法與棉墊濃縮法分為4 組，每次每組5 只裸鼠。

1.8.1 脂肪移植

每次脂肪組織取自于一位患者，脂肪的分組和處理純化方法如前所述。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠后，應用1 mL 注射器將脂肪組織移植于裸鼠雙側背部，每側背部移植脂肪量為0.5 mL，每側移植面積為1 cm×2 cm，操作時注意多方向、多隧道、多點均勻注射。

1.8.2 大體觀及稱重

脂肪移植12 周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，剪開皮膚取出移植脂肪組織，觀察移植物組織形態并稱重、記錄，最后用4%多聚甲醛固定。

1.8.3 組織學分析

各組脂肪組織常規脫水和石蠟包埋后切片，HE染色和PLIN 免疫組化染色觀察組織學特點。每組隨機抽取10 張切片，每張切片隨機選取5 個視野進行鏡下雙盲評估。每張切片根據有核脂肪細胞的完整性、囊腫或空泡的數量、纖維化及炎性反應程度分級。0 ＝無，1 ＝極少，2 ＝極少至中等，3 ＝中等，4 ＝中等至廣泛，5 ＝廣泛。

1.9 統計學方法

使用GraphPad Prism 8 進行統計分析，計量數據以表示，選擇單因素方差分析對組間數據進行兩兩比較，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 處理純化的脂肪組織含水量和細胞外油脂含量

各組處理純化后的脂肪組織含水量（圖1C）：A組25.4%±3.2%，B 組24.5%±1.5%，C 組6.2%±2.3%，D 組6.6%±2.3%。A 組與B 組大于C 組與D 組（P＜0.05）；A 組與B 組含水量無統計學差異；C組與D 組含水量無統計學差異。

各組處理純化后的脂肪組織細胞外油脂含量（圖1D）：A 組8.1%±3.4%，B 組6.9%±3.1%，C 組4.9%±2.1%，D 組2.0%±0.8%。A 組最高，與C 組及D 組相比有統計學差異（P＜0.05）；B 組大于C組及D 組（P＜0.05）；C 組細胞外油脂含量大于D組（P＜0.05）；D 組細胞外油脂含量最低，與其余各組相比均有統計學差異（P＜0.05）。

2.2 SVF 細胞數量與流式細胞分析結果

各組處理純化的脂肪組織中SVF 細胞數量：A組（1.78±0.78）×106／mL，B 組（2.07±0.91）×106／mL，C 組（2.96±1.44）×106／mL，D 組（2.87±0.89）×106／mL。A 組SVF 數量小于C 組 與D 組（P＜0.05），其余各組無統計學差異（圖2A）。

CD45＋細胞：A 組大于D 組（P＜0.05）；CD31＋CD45－細胞：B 組大于A 組（P＜0.05）。余無統計學差異（表1）。

表1 流式細胞檢測SVF 中各類細胞含量Table 1 Content of each type of cells in SVF detected by flow cytometry

2.3 G3PDH 活性

G3PDH 活性（圖2B）：A 組（0.093±0.039）U／mL，B 組（0.093±0.045）U／mL，C 組（0.144±0.023）U／mL，D 組（0.131±0.017）U／mL。C 組G3PDH 活性最高，大于A 組和B 組（P＜0.05），但與D 組的G3PDH 活性無統計學差異。D 組G3PDH 活性大于A 組和B 組（P＜0.05）。

圖2 4 種純化方法處理后脂肪SVF 細胞數量（A）與細胞活性（B）Fig.2 SVF cell number and G3PDH activity of lipoaspirate processed by 4 purification methods

2.4 處理純化的脂肪組織HE 染色結果

HE 染色顯示，經4 種不同的方法處理純化后，各組脂肪組織均有少量脂肪細胞破裂，但大部分脂肪細胞的形態較為完整，各組脂肪組織細胞的完整性在鏡下無明顯差別（圖3）。

PLIN 免疫組織化學染色顯示，各組脂肪組織均有部分細胞周脂素蛋白不完整，提示有脂肪細胞損傷，但大部分脂肪細胞形態較為完整，各組鏡下無明顯差別（圖3）。

圖3 純化脂肪組織HE 染色和PLIN 免疫染色（標尺：200 μm）Fig.3 HE staining and PLIN immunestaining of processed lipoaspirate（scale bar： 200 μm）

2.5 動物實驗結果

裸鼠死亡11 只，成活49 只，其中A 組成活10只，其余各組均成活13 只。

2.5.1 新生組織大體觀及稱重

各組新生脂肪組織形狀略不規則，外觀呈淡黃白色，表面有一層包膜包裹，觸之較柔軟，組織表面有新生細小血管形成。D 組新生脂肪組織的體積明顯大于其余3 組（圖4）。

圖4 新生組織大體形態觀察Fig.4 Gross observation of tissue samples

新生組織重量：A 組（0.081±0.041）g，B 組（0.093±0.060）g，C 組（0.085±0.053）g，D 組（0.149±0.068）g。D 組新生組織重量大于A、B、C 組（P＜0.05）。此3 組之間脂肪重量無統計學差異。

2.5.2 新生組織的組織學觀察結果

HE 染色顯示4 組新生組織周圍均有纖維組織包膜，外周可見結構較為完整的脂肪細胞，脂肪細胞大小也較為均勻，排列整齊緊密，外周纖維組織增生及淋巴細胞浸潤較明顯，而囊腫形成較少。中央部分則有組織壞死，進而形成囊腫和空腔，移植物內有血管形成。各組新生組織的有核脂肪細胞的完整性、囊腫或空泡形成、纖維化與炎性細胞浸潤均無明顯差異（表2、圖5）。

表2 不同純化方式的新生脂肪組織細胞的完整性、囊腫或空泡、纖維化和炎性浸潤分級Table 2 Grade of integrity，cysts or vacuoles，fibrosis，and inflammatory infiltration of new adipose tissue cells by different purification methods

PLIN 染色顯示4 組新生組織周圍均有PLIN＋新生脂肪細胞產生，與原有正常脂肪細胞相比，體積較小。A 組、B 組、C 組中，僅組織周圍區域發現少量散在PLIN＋新生脂肪細胞（圖5）。D 組中，組織周圍區域內可見連片的PLIN＋新生脂肪細胞，并且還可見到PLIN＋新生脂肪細胞深入到組織中間（圖6）。

3 討論

自體脂肪組織移植無免疫排異反應、組織來源充足、填充效果好，因而被廣泛應用于軟組織重建。然而，脂肪組織移植后存在較高的吸收率，并伴隨脂肪液化壞死、感染、結節形成等風險，在很大程度上制約了脂肪移植在臨床中的推廣應用。因此，提高脂肪移植后的存活率是臨床普遍關注的問題。

解決這一問題的方法主要分為兩類：第一類，優化脂肪獲取、純化及移植技術；第二類，添加外源性刺激輔助脂肪移植。目前，外源性輔助刺激手段包括細胞輔助移植（CAL）、納米脂肪、SVF－gel、脂肪脫細胞提取液、PRP 等，這些手段通過富集ADSCs 或VEGF、TGF－β、bFGF、PDGF 等生物活性因子促進組織修復、血管新生，在一定程度上明顯改善了脂肪壞死吸收，提高了脂肪移植后的存活率［14］。然而，面對復雜制備流程和倫理安全風險，這些技術的臨床廣泛應用尚存阻礙。因此，目前臨床上使用的傳統脂肪移植改良方法大多圍繞術中的處理環節開展，通過優化脂肪獲取、純化及移植的操作技巧來降低對脂肪組織的破壞，提高脂肪移植效率。其中，脂肪的純化處理是影響脂肪移植術后效果的關鍵因素，方法主要包含靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法。這些方法各有優劣，關于移植脂肪的最佳純化處理方法目前尚未達成一致意見。

本研究通過比較4 種不同方法純化處理后的脂肪的細胞完整性、脂肪活性、SVF 數量、ADSCs 含量和體內移植效果，來系統性評估不同的脂肪純化處理對脂肪移植的影響。結果表明，離心組和棉墊吸附濃縮組的體外指標總體優于靜置沉淀組和清洗沉淀組。離心法和棉墊濃縮吸附法比靜置沉淀法和清洗沉淀法更能有效去除移植物中的水分、油脂，增加有效成分比例，有助于減輕移植后受區組織炎癥反應，促進脂肪存活與再生。離心組和棉墊吸附濃縮組的SVF 數量和活性脂肪細胞更多。流式細胞分析中代表脂肪來源干細胞的CD34＋CD45－，CD105＋CD45－細胞的百分比，靜置沉淀組雖然低于其他3組，但無顯著性差異，可能原因是本實驗樣本量較少，同組中不同樣本間差異較大。但考慮到靜置沉淀組中SVF 細胞數量本來就少于其他3 組，該組脂肪來源干細胞是較少的。代表血液來源的CD45＋細胞在靜置沉淀組中最多，棉墊吸附濃縮組中最少，有顯著性差異，說明棉墊吸附濃縮組去除血液來源細胞最為徹底，對減少移植后受區炎癥反應、提高脂肪成活率有一定幫助。HE 和PLIN 免疫染色觀察顯示，4 組脂肪細胞均有少量破裂，大部分都保持完整，各組之間的細胞完整性無明顯區別。從動物實驗結果來看，棉墊吸附濃縮組結果顯著優于其余3組，值得注意的是，不同于體外指標，離心組的新生脂肪組織的重量明顯低于棉墊吸附濃縮組。離心組游離油脂含量為4.9%±2.1%，而棉墊吸附濃縮組為2.0%±0.8%。游離油脂的含量越高，說明脂肪細胞的損傷破裂程度較高。

以上結果表明，與靜置沉淀法和清洗沉淀法相比，離心法和棉墊濃縮吸附法處理的脂肪組織雜質更少、純度更高、脂肪細胞活性更好，其中又以棉墊吸附濃縮法處理更溫和，對脂肪破壞更小，體內移植存活率更高。