光激化學發光免疫分析系統檢測傳染病四項的性能評價

勞少杏 榮成智

摘要： 目的 驗證和評價LiCA500光激化學發光免疫分析系統在HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP檢測中的性能，并評估其使用價值。方法 通過設計實驗對LiCA500光激化學發光免疫分析系統進行精密度、線性范圍、檢出限/分析靈敏度及符合率等進行評價;并與安圖A2000plus、雅培ARCHITECT-i2000SR進行符合度比較。結果 HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP等的精密度、檢測限、分析靈敏度均符合相關文件標準和廠家要求;定量項目HBsAg的回歸方程為y = 1.0064x - 9.9246（r2=0.9955;a=1.0064）;且LiCA500和安圖、雅培的比較有較好的一致性，符合率>95%。結論 LiCA500初步評價各項性能良好，同時其分析樣本需求少，攜帶污染低，適用于本實驗室日常標本檢測。

關鍵詞： 光激化學發光;傳染病四項;性能評價;方法學比對

【中圖分類號】R51 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2021）06-025-02

傳染四項病篩查檢驗技術從ELISA發展到現在各類化學發光免疫分析技術，檢測的靈敏度和特異度均得到了很大的提升?？泼涝\斷LiCA500免疫分析儀是基于光激化學發光（Light Initiated Chemilnescent Assay， LiCA）免疫分析技術的全自動免疫分析系統，可定量或定性檢測血清、血漿中各類抗原或者抗體的成分。該技術來源于LOCI（Luminescent oxygen changneling immunoassay ）技術，LOCI最初由Ullman等[1]在1994年報道，后由西門子生產出了免疫診斷試劑，國產光激化學發光免疫檢測系統，是由上海博陽公司建立，也是LiCA500全自動免疫分析儀使用的配套試劑。為了評估該設備是否符合實驗室的使用要求，需要在儀器的投入使用之前對該儀器進行必要的驗證和評價。

1 材料與方法

1.1 標本來源：收集本院門診和住院患者血清，包括陽性和陰性標本，陽性數值覆蓋有低值與高值。

1.2 儀器與試劑：

1.2.1 儀器：科美LiCA500全自動光激化學發光免疫分析儀;安圖A2000plus全自動磁微粒化學發光免疫分析儀;雅培ARCHITECT-i2000SR化學發光免疫分析儀

1.2.2 試劑及標準品：

LiCA500使用博陽生物科技（上海）有限公司生產試劑及配套校準品和質控品：HbsAg，批號1901;Anti-HIV，批號1902;Anti-HCV，批號1902 ; Anti-TP，批號1903。A2000plus 使用安圖生物配套試劑：HbsAg，批號20190617;Anti-HIV ，批號20190702;Anti-HCV，批號20190516; Anti-TP，批號20190507。

ARCHITECT-i2000SR 使用雅培配套試劑：HbsAg，批號04383FN00;Anti-HIV，批號05527BE01;Anti-HCV，批號04539BE01;Anti- TP，批號05031BE01。北京康徹思坦生物有限公司校準物：Anti-HIV（2NCU/ml）批號201808003;Anti-HCV（0.5NCU/ml） 批號201902001;Anti- TP（0.5NCU/ml）批號201901001。

1.3 評價方法及標準

1.3.1 精密度評價 參考美國臨床實驗室標準化（CLSI）EP12-A[2]及EP15-A2[3]文件。按試劑說明書操作，檢測博陽生物試劑配套高、低兩個濃度水平的質控品，收集20次實驗數據，計算均值、標準差和CV值。

1.3.2 檢出限評價 參考WS/T 494-2017《臨床定性免疫檢驗重要常規項目分析質量要求》[4]文件，將康徹思坦生物有限公司校準物Anti-HIV（2NCU/ml），Anti-HCV（0.5NCU/ml），Anti- TP（0.5NCU/ml）梯度稀釋至廠商聲明的檢出限濃度（Anti-HIV 1 NCU/ml、Anti-HCV 0.16 NCU/ml和Anti- TP 0.25 NCU/ml），配置5份樣本，重復檢測，每個檢測項目收集20份數據。

1.3.3 分析靈敏度評價 參考CLSI的EP17-A[5]文件。對博陽公司“零濃度”水平的校準品，在1次運行中重復測定10次， 計算檢測結果的光信號均值（X）和SD。分析靈敏度采用空白光信號X±2SD對應的濃度值。

1.3.4 線性范圍評價 參考CLSI 的EP6-A[6]文件，選擇HbsAg對應的低濃度（L）和高濃度 （H） 標準品各一支，按要求稀釋成5個濃度水平，每份樣本平均檢測4次，計算均值。以x為預期值，y為檢測均值做線性回歸，計算相關系數（r2）和斜率（a）。

1.3.5 不同方法學比較 參考CLSI的EP9-A2[7]文件。分別檢測已知陰陽性的標本（陽性22例和陰性20例），其中陽性標本濃度涵蓋弱陽性至高值陽性值。樣本隨機分成4組，分上下午檢測，共兩天完成。根據結果計算靈敏度、特異度、符合率等指標。

1.4 結果統計分析 檢測數據使用Excel2019軟件處理;儀器符合度分析使用軟件SPSS25.0進行Kappa一致性檢驗，Kappa≥0.75，代表兩比較者有較好的一致性。

2 結果

2.1 精密度評價 LiCA500檢測HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP精密度如表1所示。

2.2 檢出限評價 檢測稀釋后的康徹思坦生物有限公司校準物Anti-HIV，Anti-HCV和Anti-TP的結果均值分別為2.87S/CO、4.60S/CO和1.92S/CO，且所有樣本均檢測出陽性，見表2。

2.3 分析靈敏度評價 定量檢測項目HBsAg檢測結果的光信號X=313和SD=17.11;X+2SD=347.22，其對應的濃度為0.04ng/ml。因此HBsAg分析靈敏度為0.04ng/ml。

2.4 線性范圍評價 HBsAg線性檢測數值見表3，經計算，相關系數r2=0.9955;斜率a=1.0064，在0.95-1.05之間。檢測回歸方程為y = 1.0064x - 9.9246。

2.5 不同檢測方法符合度分析 三臺儀器分別檢測HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP的結果見表4。在HbsAg分析中，LiCA500、ARCHITECT-i2000SR和A2000plus的靈敏度和特異度均為100%;在Anti-HIV分析中，三臺儀器的靈敏度均為100%，特異度 LiCA500和A2000PLUS為95%，ARCHITECT-i2000SR為100%;在Anti-HCV分析中，LiCA500和ARCHITECT-i2000SR的靈敏度和特異度為100%，而A2000plus的靈敏度為95.46%，特異度為95.00%;在Anti-TP分析中，三臺儀器的靈敏度和特異度均為100%。LiCA500和ARCHITECT-i2000SR檢測HbsAg的總符合率為100%，K=1;檢測Anti-HIV的總符合率為97.62%，K=0.952;檢測Anti-HCV的總符合率為100%，K=1;檢測Anti-TP的總符合率為100%，K=1。LiCA500和A2000plus檢測HbsAg的總符合率為100%，K=1;檢測Anti-HIV的總符合率為100%，K=1;檢測Anti-HCV的總符合率為95.24%，K=0.905;檢測Anti-TP的總符合率為100%，K=1。

3 討論

傳染病原體乙型肝炎（HBV）病毒、艾滋（HIV）病毒、丙型肝炎（HCV）病毒、梅毒（TP）螺旋體的傳播是威脅人們健康的公共衛生難題。大量資料表明上述疾病均可通過胎盤進行垂直傳播，常規開展孕產婦傳染病檢測是做好孕產婦保健及早期胎兒疾病預防的必要前提[8]。在不同地區不同人群，HBV、HIV、HCV和TP的感染風險和陽性率是不一樣的，其中孕產婦的HBV感染率可達9.83%，而由母嬰傳播的乙肝可高達30%～50%[9，10]。檢驗環節是孕產婦篩查及應對治療措施的關鍵點，因此，要求HBV、HIV、HCV和TP的檢測方法學具有高靈敏度及高特異度，以滿足臨床檢測的需求。

在對LiCA500精密度評價中可知HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP的總CV值均小于廠家規定的變異系數CV≤15%的要求，而且本次的CV5%，檢測結果相對穩定。在徐少華等[11]，榮楊等[12] 對LiCA免疫技術檢測HbsAg、AFP和CEA的精密度評價中，其結果與本次結論相同，可見LiCA免疫技術精密度是符合臨床樣本檢測要求。

根據儀器項目檢測方式的不同，HbsAg為定量分析，Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP為定性分析，因此本次HBsAg進行分析靈敏度分析，Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP進行檢測限分析。結果可知HBsAg分析靈敏度為0.04 ng/ml，檢測結果與張陽根等[13]結果一致，均符合廠家規定的≤0.05ng/ml要求。在檢測限分析中，博陽生物科技有限公司規定其Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP的檢測限分析分別為≤ 1NCU/ml，≤ 0.2NCU/m l和≤ 0.5NCU/ml，本次檢測在規定的要求下均能有陽性反應。

在儀器的線性分析上，本次檢測的線性范圍r2=0.9955;斜率a=1.0064，a在0.95-1.05之間，儀器線性良好，能有效的確保了檢測范圍內結果的準確性。初步評價，檢測結果均符合廠家的要求，檢測結果總體滿意，與同類檢測系統有相近的檢測水平[14]。

在LiCA500符合度分析上，本次用LiCA500、雅培ARCHITECT-i2000SR和安圖A2000plus共同檢測42例標本，三臺儀器在HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP符合率分析中均有較好的一致性，Kappa>0.75。

但是在Anti-HIV檢測中發現LiCA500和A2000plus均出現了1例假陽性，且兩者的S/CO均小于5，考慮為三臺儀器間不同方法學差異造成。首先從原理上來看，雅培ARCHITECT-i2000SR和安圖A2000plus均采用磁微?；瘜W發光技術，但是在免疫標記物上又有區分，雅培ARCHITECT-i2000SR為直接化學發光，A2000plus為酶促化學發光;而LiCA500的光激化學發光技術是通過將兩種微粒表面包被的抗原或抗體，在液相中形成免疫復合物而將兩種微粒拉近，在激光的激發下，使微粒之間的離子氧轉移，進而產生高能級的紅光，通過單光子計數器和數學擬合將光子數換算為靶分子濃度。其次根據相關研究對HIV化學發光檢測結果的S/CO陽性率驗證發現，S/CO>15才是HIV診斷的最佳臨界點，而S/CO值越小假陽性率也會越高[15]。所以三臺檢測敏感性存在差異是可以接受的。就本次比對而言LiCA500相對雅培ARCHITECT-i2000SR的檢測靈敏度高，假陽性率也相對增大，但作為日常臨床標本初篩是適用的，能減少可疑標本的漏檢。

LiCA500與科室在用的安圖A2000plu比較，存在以下優勢：其一，LiCA500單個檢測項目需要樣本量少（LiCA500最多為25ul，A2000plus最多為165ul），更加適用于標本較少的新生兒標本檢測，從臨床角度來看則能減少患者的抽血量，減輕患者痛苦。其二，由于儀器檢測使用一次性TIP槍頭，全程無清洗，也無磁珠微粒反應性步驟，并且具有避免HOOK效應的專利，因此攜帶污染的因素相對較少，儀器使用及保養也相對簡單。畢竟，婦幼醫院檢測標本以新生兒和孕產婦的為主，兩者血清中容易存在干擾性物質，如高水平膽紅素、高甘油三酯等，檢測過程中減少干擾是科室比較看重的。

綜上所述，雖然有研究[16-17]表示LiCA免疫分析技術在某一些項目的檢測上優于目前市面上使用的酶聯免疫技術、電化學發光技術和化學發光技術，具有極為廣闊的臨床、科研應用前景。但是每種分析技術的使用，又受到了試劑和檢測儀器研發的限制，每個方法都有其獨特的方面。目前在臨床標本的檢測上，推薦多種方法學的聯合檢測，才能有效的彌補各方法學、各儀器間的不足，以提高項目檢測的靈敏度和特異度[18]。本研究對LiCA500初步評價，光激化學發光免疫分析技術具有高通量，操作簡單，背景干擾少，樣本消耗少，靈敏度和特異度高等特點，各項結果均符合產家的要求，同時與目前在用的國內外儀器比對，總體符合率良好，可以用于臨床標本檢測。

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