七氟烷對(duì)低溫環(huán)境下失血性休克豬心肌保護(hù)作用及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白活性影響研究

王 麗， 鄭晶晶， 張鐵錚， 刁玉剛

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 麻醉科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)可因機(jī)體短時(shí)間內(nèi)大量失血、失液引發(fā)，為外科最常見(jiàn)的急癥之一[1]。低溫條件下發(fā)生的HS不同于常溫下的低血容量休克，具有特殊的病理生理特點(diǎn)，可引起心功能障礙，心力衰竭，最終出現(xiàn)多器官功能障礙甚至衰竭等嚴(yán)重后果[2]。HS過(guò)程中，損傷心肌局部或整個(gè)心肌組織可產(chǎn)生大量的炎癥因子及氧自由基，為造成心肌缺血缺氧損傷的重要原因之一[3]。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信號(hào)通路為介導(dǎo)炎癥介質(zhì)過(guò)度表達(dá)的重要通路之一，諸多細(xì)胞外信號(hào)均可通過(guò)JAK-STAT途徑發(fā)揮作用，對(duì)HS心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起到重要作用[4]。有研究證明，七氟醚后處理對(duì)缺血再灌注大鼠具有一定的心肌保護(hù)作用[5]，但低溫環(huán)境下七氟烷后處理心臟保護(hù)的機(jī)制尚未完全闡明。肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)濃度在心血管疾病中特異性較高，主要分布于心肌細(xì)胞中，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重或壞死時(shí)，可釋放入血。肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)升高意味著心肌損傷，可見(jiàn)于嚴(yán)重心力衰竭患者。本研究通過(guò)觀察七氟醚對(duì)低溫環(huán)境中HS心肌的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，旨在為防治HS心肌損傷提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 24頭巴馬小型豬，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 kg，月齡3～5個(gè)月。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組(S組)、HS組與七氟烷后處理組(Post/Sev組)，每組各8頭。S組：不放血，僅穿刺雙側(cè)股動(dòng)脈、頸內(nèi)靜脈置管觀察。HS組：參考文獻(xiàn)[6-7]，采用容量控制法建立巴馬小型豬HS模型。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。肌肉注射阿托品0.05 mg/kg，30 min后，肌肉注射獸用速眠新Ⅱ號(hào)0.15～0.20 ml/kg麻醉，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，氣管插管后行機(jī)械通氣，呼吸頻率14～16次/min，潮氣量8～10 ml/kg，吸入氧濃度25%。腹股溝備皮后，無(wú)菌條件下，0.5%利多卡因浸潤(rùn)麻醉，分離左側(cè)股動(dòng)脈置管，用于監(jiān)測(cè)有創(chuàng)動(dòng)脈壓；右側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管，用于放血。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔1 h肌肉注射獸用速眠新Ⅱ號(hào)0.15～0.20 ml/kg維持麻醉。經(jīng)股動(dòng)脈于15 min內(nèi)勻速將40%～50%血容量(按30 ml/kg計(jì)算)放出，使平均動(dòng)脈壓降至35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。通過(guò)回輸或放血的方法維持60 min后，視為模型制備成功。Post/Sev組：麻醉置管建立HS模型后，吸入2%七氟烷30 min，觀察4 h。實(shí)驗(yàn)中低溫環(huán)境設(shè)定為-5℃～0℃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束移出冰柜。

1.2 血清CK-MB濃度檢測(cè) 分別于休克前(T0)、休克后0.5 h(T1)、休克后1.0 h(T2)、休克后1.5 h(T3)、休克后2.0 h (T4)、休克后3.0 h (T5)及休克后4.0 h(T6)，分別采集3組動(dòng)脈血樣各1.5 ml，保存于無(wú)菌離心管中，靜置30 min后，采用TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)離心5 min，取上清液，于-80 ℃保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(Olympus AU640)檢測(cè)3組血清CK-MB濃度。每次采血后均補(bǔ)充等容量的生理鹽水。

1.3 心肌病理組織學(xué)觀察 待HS模型成功建立4 h后，麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物，取心尖組織，10%中性甲醛溶液固定過(guò)夜、脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(厚4 μm)，HE染色，光鏡下觀察心肌病理學(xué)結(jié)果。

1.4 心肌組織炎性因子水平檢測(cè) 取心尖組織，液氮中保存，制成10%組織勻漿。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)3組心肌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

1.5 心肌組織蛋白含量檢測(cè) 取心尖組織，采用Western blot法測(cè)定心肌磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1 phosphorylation，p-STAT1)。加入細(xì)胞裂解液及酶抑制劑，提取STAT1蛋白，離心后取上清液，用BCA試劑盒(sigma公司，美國(guó))測(cè)蛋白濃度。將被檢蛋白稀釋至80 μg加入上樣緩沖液，煮沸后行SDS-PAGE蛋白電泳，分離后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜，聚偏氟乙烯膜經(jīng)5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入STAT1一抗(稀釋度1∶400，北京博鰲森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌緩沖液洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(稀釋度1∶5 000，北京博鰲森生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育1 h，洗滌緩沖液漂洗濾膜。以化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(南京森貝伽生物科技有限公司)顯色后，測(cè)定條帶光密度值，以β-actin條帶為內(nèi)參。以目的條帶與β-actin條帶光密度的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。心肌磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3 phosphorylation，p-STAT3)測(cè)定方法同p-STAT1。

2 結(jié)果

2.1 各組心臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果比較 S組心肌未見(jiàn)明顯改變，心肌纖維排列整齊，胞漿、胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰；HS組心肌纖維腫脹，炎性細(xì)胞增多； Post/Sev組心肌纖維排列較整齊，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較少細(xì)胞形態(tài)異常，病理學(xué)損傷較HS組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心臟病理組織學(xué)變化情況(a.S組；b.HS組；c.Post/Sev組；HE×400)

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血液中CK-MB水平比較 與T0時(shí)比較，HS組、Post/Sev組T1～T6時(shí)間點(diǎn)CK-MB含量均顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與S組比較，HS組、Post/Sev組T1～T6時(shí)間點(diǎn)血液中CK-MB水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HS組比較，Post/Sev組T1～T6時(shí)間點(diǎn)血液中CK-MB水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血液中CK-MB水平比較

2.3 各組心肌組織中IL-6、TNF-α、cTnI、p-STAT1、p-STAT3水平比較 與S組比較，HS組、Post/Sev組心肌組織中IL-6、TNF-α、p-STAT1及p-STAT3水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HS組比較，Post/Sev組心肌組織中IL-6、TNF-α、p-STAT1及p-STAT3水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織中IL-6、TNF-α、cTnI、p-STAT1、p-STAT3水平比較

3 討論

低溫環(huán)境下的HS具有特殊的病理生理特點(diǎn)。有研究表明，早期體溫下降時(shí)，機(jī)體通過(guò)降低基礎(chǔ)代謝率來(lái)減少氧耗，但體溫持續(xù)過(guò)低將會(huì)引起機(jī)體重要器官功能抑制，嚴(yán)重創(chuàng)傷合并HS的患者易發(fā)生心功能障礙[8]。損傷心肌局部或整個(gè)心肌組織可產(chǎn)生大量的炎癥因子及氧自由基，這是心肌缺血缺氧損傷的重要原因之一。IL-6為反映心肌炎性損傷的敏感指標(biāo)，與心肌損傷的程度及心臟繼發(fā)性損害呈正相關(guān)，在心肌炎癥損傷中起到調(diào)控作用[9]。TNF-α為機(jī)體損傷時(shí)出現(xiàn)最早的炎癥因子并可通過(guò)多種信號(hào)途徑，參與心血管疾病的病理生理過(guò)程[10]。本研究結(jié)果表明，與HS組比較，Post/Sev組心肌組織中IL-6、TNF-α水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示，低溫環(huán)境下七氟醚后處理可減輕HS豬心肌損傷。

JAK-STAT信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥介質(zhì)過(guò)度表達(dá)的重要通路之一，是細(xì)胞因子信號(hào)由胞膜向核內(nèi)傳遞的主要途徑[11-12]。p-STAT1對(duì)心臟的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)炎癥反應(yīng)；p-STAT3起到心臟保護(hù)的作用[13-16]。本研究結(jié)果表明，與HS組比較，Post/Sev組心肌組織中p-STAT1及p-STAT3水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示，七氟醚后處理可下調(diào)心肌STAT蛋白的表達(dá)，減輕心肌炎性反應(yīng)。調(diào)節(jié)STAT蛋白的活性可能成為防治HS心肌損傷的新靶點(diǎn)，但目前STAT蛋白參與HS心肌損傷的確切機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，七氟烷可抑制低溫環(huán)境下HS豬心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，其機(jī)制可能與抑制心肌組織STAT蛋白活性有關(guān)。