基于高效液相色譜法的別木圖-9丸蒙藥制劑中羥基紅花黃色素A含量測定

趙欣，王麗，馬靜，成志平△，寶山，那松巴乙拉

（1包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭；2內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

別木圖-9丸具有清肝熱功能，用于受損性肝熱，肝血熱盛，黃疸，肝“寶日”病，“寶日巴達(dá)干”病。紅花是一種可活血化瘀、散瘀止痛的藥物，是一種菊科植物，其拉丁學(xué)名為Carthamus tinctorius L.[1]。該種藥物中含有一種羥基紅花黃色素A的物質(zhì)，其可通過激活BKCa通道，從而起到抑制L型Ca通道的作用，以此誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生血管舒張[2]；而且還可以有效治療機(jī)體的心肌缺血再灌注損傷、缺血性腦灌注等，有研究指出其機(jī)理可能與其抑制JAK2/STAT1通路有關(guān)，而且該種物質(zhì)還是活血化瘀的主要有效成分[3,4]。除此之外，也具有抗炎、抗氧化等作用，有研究發(fā)現(xiàn)，其可通過對MAPK、TNFR1/NF-κB等信號(hào)通路進(jìn)行有效地抑制，從而發(fā)揮降低細(xì)胞炎性反應(yīng)因子水平的作用[5-7]，是紅花發(fā)揮藥效的重要成分。故建立合理有效的測定方法對其質(zhì)量進(jìn)行控制具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本研究中采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定別木圖-9丸紅花中紅花羥基黃色素A的含量。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；色譜柱：島津C18柱（250×4.6mm 5μm）、Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm 5μm）；Thermo Accliam C18：250mm×4.6mm，5μm（美 國Thermo公 司）；Sartorius BP 211D十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；Sartorius AL 204-IC 萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

羥基紅花黃色素A對照品（111637-201810），純度：93.1%，購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純（Fisher Scientific），水為超純水；別木圖-9丸為內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院蒙藥制劑中心生產(chǎn)，批號(hào)分別為20190932、20190927、20191216，規(guī)格：2g/10丸。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

本研究中的填充劑選用十八烷基硅烷鍵合硅膠，其流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速、檢測波長、柱溫分別為1ml/min、403nm、30℃。根據(jù)羥基紅花黃色素A峰來計(jì)算其理論板數(shù)，其應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量并測定適量羥基紅花黃色素A作為對照品，加入25%甲醇，制備含0.05mg/ml的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確稱量并吸取25%甲醇50ml加入，密塞后稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，并再次稱量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法

準(zhǔn)確稱量并吸取對照品10μl、供試品10μl，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測定。

2.4 專屬性考察

按本品處方方法制備不含紅花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備不含紅花的陰性對照溶液（缺紅花），按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，陰性樣品不會(huì)對羥基紅花黃色素A的測定產(chǎn)生干擾。

2.5 線性范圍

準(zhǔn)確稱量2.48mg的羥基紅花黃色素A對照品，放入50ml容量瓶中，加25%甲醇使其溶解，稀釋至刻度處，搖晃并使其均勻，作為對照品溶液。準(zhǔn)確稱量并分別吸取1、3、5、10、15、20μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，回歸方程：羥基紅花黃色素A：Y=3396871.7X-25821.89（R2=0.9998)。結(jié)果表明羥基紅花黃色素A在0.0497-0.994ng范圍內(nèi)分別呈良好的線性關(guān)系。

2.6 重復(fù)性

準(zhǔn)確稱量后 取6份（2g/份）同一批號(hào)（批 號(hào)：20190932）的供試品，分別按上述供試品溶液的制備和色譜條件進(jìn)行測定，照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0512），在403nm波長處測定峰面積，按外標(biāo)峰面積計(jì)算。測定每份樣品的含量。進(jìn)樣量各10μl。其RSD為1.44% (n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取同一份供試品（批號(hào)20190932）溶液，按上述色譜條件，分別在0h、2h、4h、12h、24h進(jìn)行測定，記錄峰面積。24h的RSD 為0.04% (n=6)。從數(shù)據(jù)中可見，羥基紅花黃色素A在24h內(nèi)的面積積分值基本穩(wěn)定不變。

2.8 準(zhǔn)確度

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱量后取6份（1g/份）同一批號(hào)（批號(hào)：20190932）的供試品，置具塞錐形瓶中，分別加入對照品溶液50ml（其中羥基紅花黃色素A濃度為0.029mg/ml），按2.2.2及2.1進(jìn)行測定，準(zhǔn)確記錄色譜圖，并對回收率進(jìn)行計(jì)算，平均回收率為98.95%，其RSD為0.74%。

2.9 耐用性試驗(yàn)

結(jié)果見表1。

表1 不同色譜柱的耐用試驗(yàn)

2.10 樣品測定

依據(jù)建立的羥基紅花黃色素A含量測定方法，對3批次別木圖-9丸中的羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行考察，其羥基紅花黃色素A含量分別為1.44、1.81、1.74mg/g。

3 討論

3.1 溶劑

參照《中國藥典》（2015年版），其中使用甲醇作為提取溶劑，同時(shí)與25%甲醇作溶劑進(jìn)行提取效率考察，結(jié)果25%甲醇作溶劑，測得含量高于甲醇提出量，且干擾成分少，由于試驗(yàn)樣品的分離效果良好，所以確定了25%甲醇作為提取溶媒。

3.2 提取

《中國藥典》（2015年版）中“紅花”的超聲提取方法比較成熟，因此選擇超聲波提取，時(shí)間為30min。

3.3 流動(dòng)相

根據(jù)《中國藥典》（2015年版），采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）作為流動(dòng)相，結(jié)果分離效果好、保留時(shí)間適中，故確定為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）為流動(dòng)相。

3.4 柱溫

在實(shí)驗(yàn)中，筆者比較了30℃和40℃的柱溫，雖然保持時(shí)間略有不同，但是分離度和理論板數(shù)沒有變化，因此本研究使用了30℃的柱溫。

3.5 波長

本研究使用二極管陣列檢測器掃描了200-800nm范圍內(nèi)的羥基紅花黃色素A的光譜。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A在401nm處具有吸收峰。根據(jù)《中國藥典》（2015年版）中紅花的含量測定方法，選擇403nm作為檢測波長。

按原處方比例，本實(shí)驗(yàn)室自制的別木圖-9丸模擬樣每g含有羥基紅花黃色素A2.535-0.063mg/50ml，以模擬樣藥材為原料制成的批號(hào)為20190932的別木圖-9丸中羥基紅花黃色素A含量為1.663mg/g，轉(zhuǎn)移率為77.33 %。《中國藥典》2015年版一部要求紅花中羥基紅花黃色素A的含量不得低于1.00%，按此含量、處方量及轉(zhuǎn)移率計(jì)算，別木圖-9丸中應(yīng)含有羥基紅花黃色素A1.286 mg/g。參考以上測定結(jié)果、回收率、生產(chǎn)工藝及批間差異，擬規(guī)定別木圖-9丸紅花中羥基紅花黃色素A（C27H32O16）計(jì)，不得少于0.90 mg/g。

綜上所述，本文建立了蒙藥別木圖-9丸紅花中羥基紅花黃色素A的含量測定方法，該方法科學(xué)、簡便、專屬性較強(qiáng)，為促進(jìn)蒙藥標(biāo)準(zhǔn)化、提高蒙藥發(fā)展水平具有一定的積極意義[8]。