SRT1720 抑制巨噬細胞泡沫化最佳給藥時間的實驗研究

蔣藝華，王 倩，蔡金玉，呂雪陽，王 琦，周 曉，李菁菁，2

（1.徐州醫科大學醫學影像學院，江蘇 徐州 222004；2.徐州醫科大學附屬醫院醫學影像科，江蘇 徐州 222004）

巨噬細胞泡沫化（macrophage foam）是動脈粥樣硬化的重要因素，脂質的過量存積則是泡沫化的主要原因，減少細胞內己經存積的脂質對抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙?；?（SIRT1）通過減少泡沫細胞的形成阻止動脈粥樣硬化[4-6]，使肝X 受體（LXR）去乙?；罂梢陨险{后者的活性，促進膽固醇逆轉運將膽固醇從細胞內排出，通過抑制早衰防止內皮功能紊亂。已證實SIRT1 在巨噬細胞中可以降低動脈粥樣硬化的發生。此外，還有研究發現SIRT1 通過抑制NF-kB 信號通路[7]降低凝集素樣ox-LDL 受體-1（Lox-1）的表達，從而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取[8，9]。SIRT1 在穩定斑塊、降低膽固醇攝取、抑制巨噬細胞泡沫化以及減輕炎癥反應等方面的積極作用，使其成為防治動脈粥樣硬化的新靶標。SRT1720 是人工合成的SIRT1 特異性激活劑，SRT1720 通過與氨基末端催化區的變構位點結合，連接到SIRT1 酶-肽底物復合物上，降低乙?；孜锏拿资铣抵?，從而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14]，SRT1720 可以抑制巨噬細胞泡沫化，但是對于SRT1720 的干預時間對巨噬細胞的泡沫化的抑制效果的影響報道罕見，本研究分別在巨噬細胞經ox-LDL 干預不同時間后加入SRT1720，觀察SRT1720 的干預時間對治療效果的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購于中國科學院細胞庫（上海），氧化低密度脂蛋白ox-LDL 購于上海源葉生物科技有限公司（上海），SIRT1 激活劑SRT1720 購于大連美倫生物科技有限公司（大連），油紅O 購于上海索橋生物科技有限公司（上海），總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所（南京）。

1.2 方法 將巨噬細胞RAW264.7 種植于3 個24 孔細胞培養板，每個培養板分3 組培養細胞，Control組只加培養基，ox-LDL 組加60 μg/ml ox-LDL，ox-LDL+SRT1720 組先加60 μg/ml ox-LDL，分別培養不同時間（0、12、24 h）后再加入10 μmol/L SRT1720干預，采用油紅O 染色和膽固醇測定，比較巨噬細胞泡沫化抑制情況。

1.2.1 油紅O 染色 細胞培養終止后，去掉原細胞培養液，PBS 漂洗3 次，5 min/次；用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，固定結束后PBS 漂洗5 min×2 次；取油紅O 儲備液6 ml，加入蒸餾水4 ml 配成油紅O工作液，混合后靜置10 min，濾紙避光過濾后配成油紅O 工作液，每孔加入油紅O 工作液200 μl，避光染色40 min；蒸餾水洗10 s×2 次，光鏡下觀察并拍照。

1.2.2 膽固醇含量測定 細胞培養結束，光鏡下帶200 μm 標尺拍照，隨機取10 個細胞，通過細胞與標尺的比例關系計算平均細胞直徑，細胞密度取水的密度，由球體體積計算公式和細胞質量計算公式算出細胞質量；對細胞進行消化分離，制備細胞懸液并取出，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀；用PBS 清洗2 次，取少量細胞懸液計數，計算每孔的細胞數量，計算細胞質量；清洗后以1000 r/min 離心速度離心10 min；棄上清液，留細胞沉淀；加入0.2 ml 無水乙醇進行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎（功率300 W，3 s/次，間隔9 s，重復5 次），制備好的勻漿直接測定；準備96 孔板，以樣本工作液為1∶100 比例混勻，每個樣本3 個平行組加入96 孔板中；37 ℃孵育10 min，設置分光光度計波長510 nm，測定各管吸光度值；膽固醇含量（mmol/g 組織）=（樣本OD 值-空白OD 值）/（校準OD 值-空白OD 值）×校準品濃度（mmol/L）/待測樣本質量濃度（g/L）。

1.3 統計學方法 油紅O 染色拍照結束后，采用Image J 分析軟件計算出染紅區域面積和細胞總面積的比值，對油紅O 染色的巨噬細胞進行定量分析；采用SPSS 25.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，用沃勒-鄧肯（W）法進行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下觀察油紅O 染色處理組巨噬細胞泡沫化情況 o-xLDL 組及ox-LDL+SRT1720 組0、12、24 h細胞泡沫化程度均高于Control 組，其中0 h 加入SRT1720 對巨噬細胞泡沫化的抑制效果最佳，見圖1～圖3。

圖1 ox-LDL 與SRT1720 同時干預后巨噬細胞的脂質沉積

圖2 ox-LDL 處理12 h 后加入SRT1720 干預后巨噬細胞的脂質沉積

圖3 ox-LDL 處理24 h 后加入SRT1720 干預后巨噬細胞的脂質沉積

2.2 油紅O 染色

2.2.1 ox-LDL 處理不同時間加入SRT1720 的巨噬細胞油紅染色比 SRT1720 直接干預可以顯著抑制巨噬細胞的泡沫化，隨著泡沫化程度的增加，藥物的抑制效果呈遞減趨勢，見圖4。

圖4 ox-LDL 處理不同時間加入SRT1720 的巨噬細胞油紅染色比

2.2.2 各組細胞中油紅染色脂質沉積比較 與Control組比較，ox-LDL 組0、12、24 h 油紅染色比均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+SRT1720 組0、12 h 油紅染色比降低，差異有統計學意義（P＜0.05），24 h 組油紅染色比略降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；巨噬細胞泡沫化后，SRT1720 越早期給藥其抑制效果越佳，見表1。

表1 各組細胞中油紅染色脂質沉積比較（，%）

表1 各組細胞中油紅染色脂質沉積比較（，%）

注：與Control 組比較，**P＜0.05；與ox-LDL 組比較，*P＜0.05

2.3 膽固醇測定 與Control 組比較，ox-LDL 組0、12、24 膽固醇含量均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+SRT1720 組0 h膽固醇含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05），12、24 h 膽固醇含量均略減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；在巨噬細胞剛開始泡沫化時SRT1720 給藥有抑制效果，見表2。

表2 各組細胞中膽固醇含量比較（，mmol/g）

表2 各組細胞中膽固醇含量比較（，mmol/g）

注：與Control 組比較，**P＜0.05；與ox-LDL 組比較，*P＜0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是慢性炎癥性、嚴重危害人類健康的疾病，而脂質氧化在動脈粥樣硬化的形成與發展過程中起著重要作用。有研究表明[2]，巨噬細胞參與了動脈粥樣硬化的全過程，是泡沫細胞形成過程中的關鍵因素；另有研究報道[14]，在兔主動脈晚期動脈粥樣硬化病灶中大約45%的細胞，在人冠狀動脈粥樣硬化病灶中超過50%的細胞屬于VSMC 來源，且多于巨噬細胞。血液中的單核細胞會在血管內皮受損的情況下通過內皮間隙，然后在內膜下轉化為巨噬細胞，巨噬細胞可以介導滲入血管內皮下的低密度脂蛋白（LDL）發生氧化修飾，最終形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬細胞吞噬大量ox-LDL，導致細胞內脂質堆積，最終形成泡沫細胞。因此，減少膽固醇的流入或增加其流出對減少動脈粥樣硬化的發生具有十分重要的意義。

已有研究表明，SIRT1 是去乙酰化酶家族（SIRT1-7）的一員，在維持細胞能量、脂質代謝及葡萄糖穩態等方面發揮重要作用[7]。近年來，SIRT1 在動脈粥樣硬化防治方面的保護作用逐漸受到研究者的關注。SRT1720 是人工合成的SIRT1 特異性激活劑，通過與氨基末端催化區的變構位點結合，連接到SIRT1 酶-肽底物復合物上，降低乙?；孜锏拿资铣抵?，從而激活SIRT1。曹小潔等[7]的研究已證明SRT1720 可以抑制ox-LDL 誘導的泡沫細胞的形成，但是對其最佳的給藥時間尚無研究。為了提高藥物的利用率和降低藥物對人體的傷害，不同時期的動脈粥樣硬化治療應該對應不同的藥物。SRT1720 具有一定的毒性，因此通過設定準確的服藥時間，不僅可以給獲得較好的治療效果，還能降低不必要用藥給人體帶來的危害。

本研究采用在同等操作環境下，巨噬細胞經ox-LDL 處理不同時間SRT1720 給藥，比較巨噬細胞泡沫化的抑制情況。油紅O 染色和膽固醇測定結果顯示，ox-LDL 干預時間越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL 與SRT1720 同時加入可以顯著抑制巨噬細胞的泡沫化，由此推測動脈粥樣硬化在此時期給予SRT1720 治療，幾乎可以完全抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取。而隨著泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720 抑制巨噬細胞泡沫化的效能有所降低。因此推測SRT1720 可以抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝入，對已經泡沫化的巨噬細胞發生逆向轉變的效果并不明顯。

研究顯示[15]，在動脈粥樣硬化早期發現疾病的患者較少，動脈粥樣硬化疾病早期病理變化和特征性標志是斑塊內泡沫巨噬細胞的浸潤，泡沫細胞的數量和分布是引起斑塊不穩定性的重要發病基礎，與臨床急性心血管事件的發生呈顯著相關。有研究試圖通過影像學手段，實現對動脈粥樣硬化易損斑塊形態和成分性質的早期可視化診斷[16]，經過診療一體化納米粒子[17]的預治療，可以降低血管完全堵塞的風險。尤其是對斑塊內泡沫巨噬細胞進行早期識別及動態定量監測，對于預防急性心腦血管事件的發生具有重要意義，因此診療一體化納米探針的制備在預防動脈粥樣硬化斑塊形成的研究具有重要意義。

綜上所述，SRT1720 對于動脈粥樣硬化的早期治療效果最好。如果可將其制成納米探針，對斑塊內泡沫巨噬細胞進行早期靶向診斷治療。由于研究表明對于中晚期的動脈粥樣硬化巨噬細胞泡沫化抑制情況并不明顯，因此其治療方法及加藥量尚不明確。SRT1720 對巨噬細胞泡沫化的影響還有待進一步研究，可能對于提高其臨床的治療效果具有重要意義。