沉積物中無(wú)機(jī)硒對(duì)霍甫水絲蚓的生物效應(yīng)研究

李瀟，李丹，羅藝璇，楊紀(jì)琛，劉洪宋，雷浩俊，陳紅星,*，謝凌天

1. 華南師范大學(xué)環(huán)境研究院，廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006 2. 華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州 510006

沉積物是水體環(huán)境污染物的主要的匯，同時(shí)沉積物也是底棲動(dòng)物生活的主要場(chǎng)所，底棲動(dòng)物通過(guò)生物擾動(dòng)等可加速污染物從沉積物向水體的遷移，使得沉積物成為水體污染物的源[1]。此外，沉積物也是多種等寡毛綱底棲動(dòng)物的主要食物來(lái)源，其通過(guò)吞吐和消化沉積物，從沉積物中獲取有機(jī)質(zhì)等食物，但其中的污染物也常常被攝入體內(nèi)，對(duì)生物體及水生食物鏈造成潛在危害和風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。

硒是動(dòng)物體必需微量元素之一，低劑量硒常具有拮抗氧化應(yīng)激的作用，并抑制親巰基二價(jià)金屬離子的生物累積和毒性(如汞、鎘和鉛等)，但是過(guò)量硒對(duì)生物體又可產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)[4-7]。研究顯示，對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物而言，過(guò)量硒的毒性和汞毒性相當(dāng)，且遠(yuǎn)大于鎘的毒性[8]。水體中硒主要以無(wú)機(jī)硒形態(tài)存在，其中主要是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)[9]，土壤及沉積物中無(wú)機(jī)硒主要形態(tài)也以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)為主[10-12]。研究表明，沉積物中硒主要分布于表層(～90%)，硒濃度一般低于1 μg·g-1(干質(zhì)量)，并隨深度降低(如深度30 cm處濃度僅～0.3 μg·g-1干質(zhì)量)，而富硒或硒污染底棲環(huán)境硒濃度可達(dá)4～30 μg·g-1(干質(zhì)量)[13]。痕量元素的遷移性和生物可利用性與其化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，序列提取分析表明，硒非殘?jiān)鼞B(tài)在總含量中所占的比例相對(duì)較高，有著較高的生物可利用性和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。

底棲動(dòng)物群落的穩(wěn)定性，在很大程度上反映了整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的健康程度[14]。底棲動(dòng)物定量定點(diǎn)采集容易，其運(yùn)動(dòng)不敏捷，可真實(shí)反映固定區(qū)域的污染水平，其種類的多樣性比魚(yú)類大，對(duì)水體污染的耐受性和適應(yīng)性因種類或分類群的不同而有較大變化，因而底棲動(dòng)物可在河流生態(tài)評(píng)價(jià)中用作指示生物，歐美國(guó)家也已將底棲動(dòng)物作為水質(zhì)指示動(dòng)物[15]。此外，通過(guò)底棲動(dòng)物進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)可了解到水質(zhì)的長(zhǎng)期變化，綜合表征污染物的毒性。水環(huán)境中部分搖蚊幼蟲(chóng)[1]和寡毛綱少數(shù)種(如霍甫水絲蚓)等被廣泛用來(lái)作為水體污染指示生物[2]。

食物相硒是過(guò)量硒毒性的主要作用途徑[5, 16]。底棲食物網(wǎng)中，水體底棲生物中的硒是食物鏈硒傳遞和累積的重要一環(huán)[17]。霍甫水絲蚓為底棲環(huán)境的優(yōu)勢(shì)種之一，作為耐污種在水生態(tài)評(píng)價(jià)中具有重要地位[16,18]。以往研究多認(rèn)為底棲動(dòng)物對(duì)污染物耐受性較高，其本身只是作為污染物在食物鏈中傳遞的媒介，其本身受到的影響研究很少。我們前期探討了霍甫水絲蚓對(duì)沉積物中無(wú)機(jī)硒的擾動(dòng)作用，發(fā)現(xiàn)霍甫水絲蚓可以通過(guò)打洞和攝食等方式改變沉積物/水界面硒的分布[16]。反之，沉積物中無(wú)機(jī)硒是否對(duì)其中的底棲動(dòng)物造成一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)有待研究。因此，本研究將典型底棲動(dòng)物霍甫水絲蚓暴露于2種無(wú)機(jī)硒(Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ))，通過(guò)測(cè)定抗氧化系統(tǒng)(TBARS、CAT、SOD和GST)、神經(jīng)系統(tǒng)(AChE)和消化系統(tǒng)(α-葡糖苷酶)酶活性的變化，探討無(wú)機(jī)硒對(duì)底棲動(dòng)物的生物效應(yīng)，為沉積物中無(wú)機(jī)硒對(duì)底棲動(dòng)物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

霍甫水絲蚓購(gòu)自廣州市水產(chǎn)市場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室中于18 L玻璃缸中暫養(yǎng)。水絲蚓暴露實(shí)驗(yàn)所用溶液根據(jù)ASTM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制(48 mg·L-1NaHCO3，30 mg·L-1CaSO4·2H2O，30 mg·L-1MgSO4，2 mg·L-1KCl，pH 7.4)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始1周前挑選體長(zhǎng)大致等同的霍甫水絲蚓成體，將水絲蚓轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)環(huán)境，每天喂食少量粉末飼料(tetramin)，飼料含粗蛋白>47%，粗脂肪>10%，粗纖維<3%，水分<6%，磷>1%，維生素A>15 000 IU·kg-1，維生素B12 110 mg·kg-1，維生素C 390 mg·kg-1，維生素D3 1 400 IU·kg-1，維生素E 140 IU·kg-1，煙酸700 mg·kg-1，肌醇1 400 mg·kg-1，膽堿2 100 mg·kg-1，生物素>1 mg·kg-1，Omega-3脂肪酸8 000 mg·kg-1。

實(shí)驗(yàn)所需所有容器均在實(shí)驗(yàn)前于50%硝酸溶液中清洗，并由超純水沖洗后烘干使用。亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se(Ⅳ))和硒酸鈉(Na2SeO4·10H2O，Se(Ⅵ))購(gòu)于Sigma-Aldrich (美國(guó))。

1.2 硒沉積物暴露

實(shí)驗(yàn)所需沉積物取自廣州水源地(113°47'42"N，23°46'01"E)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將沉積物過(guò)篩(500 μm)，-80 ℃冷凍殺滅其中的生物，48 h后解凍，沉降并去除上覆水對(duì)沉積物進(jìn)行檢測(cè)。沉積物水分含量為56%，總氮(TN)、總磷(TP)、氨(NH4+)和總有機(jī)碳(TOC)含量分別為0.15%、0.05%、0.01%和2.1%。烘干后檢測(cè)其砂含量為0.5%，粉砂含量為40.8%，黏土含量為58.7%。所用沉積物總硒背景值約為0.2 μg·g-1(干質(zhì)量)[16]。

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置9個(gè)處理組：空白對(duì)照組，4個(gè)Se(Ⅳ)處理組(2、5、20和40 μg·g-1干質(zhì)量)，4個(gè)Se(Ⅵ)處理組(2、5、20和40 μg·g-1干質(zhì)量)，每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)平行，共54個(gè)燒杯。其中，3個(gè)平行(27個(gè)燒杯)用于暴露2周后的測(cè)定，另外3個(gè)平行用于暴露2個(gè)月后的測(cè)定。通過(guò)計(jì)算沉積物含水量，分別向處理組加入一定量對(duì)應(yīng)形態(tài)的硒母液并攪拌均勻。室溫條件下平衡48 h，隨后將沉積物分放在酸洗過(guò)的1 L玻璃燒杯中，每個(gè)燒杯放入約450 g沉積物(濕質(zhì)量)，沉積物高度約為2.5 cm。每個(gè)燒杯加入如上配制的ASTM標(biāo)準(zhǔn)溶液600 mL，并用記號(hào)筆標(biāo)識(shí)液面位置。隨后，每個(gè)燒杯中放入2 g霍甫水絲蚓(約200條)。光照周期為16 h光照∶8 h黑暗，水絲蚓硒暴露期間不喂食(水絲蚓以沉積物中有機(jī)質(zhì)為食)，不曝氣，每隔2 d加入適量純水(DI水)至標(biāo)識(shí)的液面位置，避免上覆水體積由于揮發(fā)等因素造成大幅波動(dòng)。

暴露2周和2個(gè)月后，分別收集各燒杯中的水絲蚓，在干凈的配制水中清空腸道6 h。隨后，用紙拭干水絲蚓體表水分，稱量質(zhì)量，于-80 ℃冰箱保存，用于各個(gè)生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

每個(gè)生化指標(biāo)測(cè)定均選取約20 mg水絲蚓，測(cè)定采用6個(gè)重復(fù)(n=6)。將各組織樣品按1∶9質(zhì)量體積比(1 mg∶9 μL)加入預(yù)冷生理鹽水，冰浴勻漿，離心取上清備用。脂質(zhì)過(guò)氧化水平和酶活性測(cè)定均采用96孔板法于酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)物質(zhì)特性選擇相應(yīng)波段確定其濃度與吸光度的關(guān)系，具體步驟參考本實(shí)驗(yàn)室近期研究中的方法進(jìn)行[19-21]。生化指標(biāo)包括抗氧化系統(tǒng)中脂質(zhì)過(guò)氧化水平、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性，神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(AChE)活性，以及消化系統(tǒng)中α-葡萄糖苷酶(α-Glu)活性。脂質(zhì)過(guò)氧化水平通過(guò)測(cè)量硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)含量來(lái)確定，結(jié)果表示為nmol·mg-1protein。酶活性的單位定義為單位總蛋白濃度對(duì)應(yīng)的酶活性(mU·mg-1protein或U·mg-1protein)，總蛋白濃度用Bradford方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)，采用GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，用Kolmogorov-Smirnov和Levene方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey法進(jìn)行分析及多重比較(顯著性水平為P<0.05)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

霍甫水絲蚓在硒暴露后，體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平(TBARS含量)受到暴露時(shí)間的影響較大，而受到價(jià)態(tài)的影響較小。暴露2周后，水絲蚓體內(nèi)TBARS水平整體是升高趨勢(shì)，在2～20 μg·g-1濃度區(qū)間有一個(gè)明顯的上升峰值，且在5 μg·g-1和40 μg·g-1這2個(gè)濃度處理組顯著升高，5 μg·g-1暴露組遠(yuǎn)高于40 μg·g-1暴露組(圖1(A1))；暴露2個(gè)月后，TBARS水平在2～20 μg·g-1濃度區(qū)間有一個(gè)降低的峰值，隨后隨著濃度升高逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平(圖1(B1))。

水絲蚓體內(nèi)TBARS水平在暴露2周后升高，可能是由于水絲蚓對(duì)于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高。無(wú)機(jī)硒進(jìn)入水絲蚓體內(nèi)，進(jìn)行一系列氧化-還原反應(yīng)，從而生成過(guò)量自由基，造成一定的脅迫效應(yīng)[3,5,22]。研究表明，夾雜帶絲蚓(Lumbriculusvariegatus)暴露于20 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 2周后，體內(nèi)TBARS水平顯著升高[3]，而0.6 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露可顯著提高仿刺參(Stichopusjaponicas)體內(nèi)耗氧率[23]，提示硒的短期暴露對(duì)自由基水平的促進(jìn)作用。隨著暴露濃度的升高，水絲蚓體內(nèi)TBARS水平并不是線性升高，而僅在5 μg·g-1和40 μg·g-1暴露組顯著高于對(duì)照組，且低濃度暴露組(5 μg·g-1)高于高濃度暴露組(40 μg·g-1)，表明5 μg·g-1暴露條件下，水絲蚓對(duì)硒的吸收和轉(zhuǎn)化較為迅速，可能屬于主動(dòng)吸收階段；而在最高濃度40 μg·g-1條件下，過(guò)高的硒濃度可能造成其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的損傷，水絲蚓對(duì)于硒的吸收轉(zhuǎn)為被動(dòng)吸收階段，從而通過(guò)降低生物累積因子等[16,24]途徑降低過(guò)量硒對(duì)生物體的毒性效應(yīng)。安德愛(ài)勝蚓(Eiseniaandrei)通過(guò)濾紙接觸法暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 48 h后，其體內(nèi)TBARS水平也顯著升高，和本研究結(jié)果類似，該研究也發(fā)現(xiàn)這2種無(wú)機(jī)硒對(duì)蚓體TBARS水平的誘導(dǎo)不是線性變化，而是僅在中間濃度(0.5 μg·cm-2)和最高濃度(5 μg·cm-2)有顯著升高[25]。而暴露2個(gè)月后，低濃度硒暴露似乎對(duì)水絲蚓有一定的有益作用(2～20 μg·g-1)，表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化水平的降低，而高濃度又逐漸升高其體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平，暗示過(guò)量硒暴露條件下，硒有益效應(yīng)的消失或者毒性效應(yīng)的出現(xiàn)[4,7]。

2.1.2 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓抗氧化酶活性的影響

水絲蚓體內(nèi)3種抗氧化酶活性(CAT、SOD和GST)在暴露2周后，其變化趨勢(shì)相似，但是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組差異明顯。Se(Ⅳ)暴露后，抗氧化酶活性隨著暴露濃度逐漸升高，并在20～40 μg·g-1達(dá)到平衡；而Se(Ⅵ)暴露后，抗氧化酶活性在5 μg·g-1達(dá)到峰值，并隨后逐漸降低到對(duì)照組水平(圖1(A2)～(A4))。有趣的是，硒暴露2個(gè)月后，水絲蚓體內(nèi)3種抗氧化酶的活性基本僅受到硒暴露濃度的影響，而不受硒價(jià)態(tài)的影響(圖1(B2)～(B4))(除2 μg·g-1處理組的SOD外)，其中，CAT酶活性在5 μg·g-1顯著降低，SOD酶活性在2～5 μg·g-1升高，GST酶活性和對(duì)照組沒(méi)有差異。

圖1 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓抗氧化系統(tǒng)的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 The effects of selenium exposure on the antioxidant system of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); TBARS means thiobarbituric acid reactive substances; SOD means superoxide dismutase; CAT means catalase; GST means glutathione S-transferase.

Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的化學(xué)性質(zhì)不同，可能導(dǎo)致不同價(jià)態(tài)硒的短期暴露(2周)生物效應(yīng)差異。二者在生物體內(nèi)的還原過(guò)程雖然類似，但是Se(Ⅵ)需要先被還原為Se(Ⅳ)，然后才能進(jìn)行下一步的還原過(guò)程，同等條件下Se(Ⅵ)可以造成更多的氧自由基的產(chǎn)生[26-27]。因此，可能造成了Se(Ⅵ)在較低濃度如5 μg·g-1即造成了抗氧化酶活性的顯著升高，且隨著Se(Ⅵ)濃度升高，迅速超過(guò)機(jī)體的抗氧化能力，從而造成抗氧化系統(tǒng)的失衡及抗氧化酶活性的降低；而Se(Ⅳ)的還原可能產(chǎn)生較少的氧自由基，因此Se(Ⅳ)在20 μg·g-1才造成抗氧化酶活性的顯著升高。

暴露2個(gè)月后，水絲蚓體內(nèi)抗氧化酶活性的變化和暴露2周差異較大。類似研究表明，泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)暴露于4.6～18.4 mg·L-1的Se(Ⅳ)2～3 d后，體內(nèi)抗氧化酶活(SOD、GST等)明顯升高，暴露4 d后恢復(fù)到對(duì)照組水平[28]；沙蠶(Nereisdiversicolor)暴露于3.7 μg·g-1Se(Ⅳ)5 d后，體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性升高，暴露10 d后也恢復(fù)到對(duì)照組水平[29]，這些研究表明，硒對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響受到暴露時(shí)間的顯著影響。此外，硒長(zhǎng)期暴露后價(jià)態(tài)的影響幾乎消失，可能和硒的生物轉(zhuǎn)化和價(jià)態(tài)變化等因素有關(guān)[27]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.1.3 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓的雙重生物效應(yīng)

2.1.3.1 有益效應(yīng)

適量硒對(duì)生物體有一定的有益效應(yīng)，具有抗氧化等作用。本研究顯示，暴露2個(gè)月后，水絲蚓體內(nèi)TBARS水平在2～20 μg·g-1濃度范圍降低。類似研究表明，桑蠶(BombyxmoriL.)在第5幼蟲(chóng)期后攝食酵母硒(4～32 μg·g-1，7 d)，可增加其體質(zhì)量及所產(chǎn)幼蠶的數(shù)量[30]。硒對(duì)多種重金屬的生物累積和毒性還具有拮抗作用，硒可通過(guò)抗氧化作用降低金屬產(chǎn)生的過(guò)量自由基，硒預(yù)暴露可降低銅在夾雜帶絲蚓體內(nèi)的累積和TBARS水平[6]，還可降低鎘在小鳉魚(yú)(Heterandriaformosa)體內(nèi)的累積和TBARS水平[5]。也有研究認(rèn)為無(wú)機(jī)硒如Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)為陰離子，進(jìn)入生物體后，可和陽(yáng)離子金屬形成硒-金屬-蛋白復(fù)合體，改變金屬對(duì)生物大分子的活性位點(diǎn)，降低金屬的毒性效應(yīng)[31]，如2～10 μg·g-1Se(Ⅳ)可以降低銻元素在赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)體內(nèi)的累積和毒性[31]；15～50 μg·g-1Se(Ⅳ)可降低夾雜帶絲蚓體內(nèi)汞的累積(～80%)等[32]。

值得注意的是，硒的有益濃度范圍較窄，并且過(guò)高或過(guò)低可以引起硒的毒性效應(yīng)[4]。本研究中霍甫水絲蚓在硒暴露2周和2個(gè)月后，在2～20 μg·g-1濃度區(qū)間均存在峰值。已有的研究也顯示，刺參(Apostichopusjaponicus)攝食硒餌料28 d，適宜酵母硒濃度(0.8～1.6 μg·g-1)可以提高其免疫能力及抗氧化酶活性，而低濃度(0.2 μg·g-1)和高濃度(3.2～6.4 μg·g-1)均沒(méi)有促進(jìn)作用[33]。蚯蚓(Dendrobaenaveneta)暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 15 d后，CAT只在適宜濃度(0.1 μg·g-1)降低，而在低硒(0.01 μg·g-1)和高硒(1 μg·g-1)濃度均和對(duì)照組無(wú)差異[34]。這些研究表明，硒作為動(dòng)物體必需元素之一，其添加量必須控制在一個(gè)合理范圍。

2.1.3.2 毒性效應(yīng)

過(guò)量硒對(duì)生物體的毒性效應(yīng)也不容忽視。研究表明，對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物如刺參幼參來(lái)說(shuō)，硒和汞同屬于劇毒物質(zhì)，其毒性遠(yuǎn)高于鎘[8]。不少研究報(bào)道了過(guò)量硒的毒性效應(yīng)，赤子愛(ài)勝蚓暴露于46 μg·g-1Se(Ⅳ) 49 d后，其種群數(shù)量降低了約1/3[35]；白蚯蚓(Enchytraeuscrypticus)暴露于6.2 μg·g-1Se(Ⅵ) 28 d后，其種群數(shù)量也降低了約50%[36]；秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)暴露于78.9 μg·g-1Se(Ⅳ) 9～55 h后(全生命周期)，不同生長(zhǎng)期生長(zhǎng)及繁殖均受到抑制[37]。

此外，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)對(duì)底棲動(dòng)物的毒性存在差異。霍甫水絲蚓暴露于硒2個(gè)月后，5 μg·g-1Se(Ⅳ)降低了其種群數(shù)量約1/4，而>20 μg·g-1Se(Ⅵ)才開(kāi)始降低其種群數(shù)量[16]。在安德愛(ài)勝蚓硒的48 h急性毒性實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)Se(Ⅳ)的毒性約為Se(Ⅵ)的4.6倍[25]。在過(guò)量硒存在的條件下，Se(Ⅳ)對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的毒性高于Se(Ⅵ)，可能和其較高的生物累積速率[16]和較快的生物還原過(guò)程等[3]因素相關(guān)。

2.2 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓神經(jīng)酶活性的影響

硒暴露2周后，霍甫水絲蚓體內(nèi)AChE酶活性受影響較小，只有5 μg·g-1Se(Ⅳ)暴露增加了水絲蚓體內(nèi)AChE酶活性，而暴露2個(gè)月后，隨著濃度升高，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)都降低了水絲蚓體內(nèi)AChE酶活性，且在5～40 μg·g-1達(dá)到平衡狀態(tài)。總體而言，霍甫水絲蚓體內(nèi)AChE酶活性幾乎沒(méi)有受到硒價(jià)態(tài)差異的影響。此外，對(duì)照組霍甫水絲蚓體內(nèi)AChE酶活性的平均水平在不同暴露時(shí)間段有較大變化，2個(gè)月后其體內(nèi)AChE酶活性普遍高于2周，可能受到不同生長(zhǎng)階段的影響(圖2)。

圖2 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓神經(jīng)酶活性的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 The effects of selenium exposure on the nervous enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control (P<0.05); AChE means acetylcholinesterase.

硒暴露會(huì)降低無(wú)脊椎動(dòng)物AChE酶活性的結(jié)果已有報(bào)道，Se(Ⅳ)可以降低沙蠶(3.7 μg·g-1，5～10 d)[29]和蚯蚓(0.1 μg·g-1，15 d)[34]體內(nèi)AChE酶活性；Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)可降低安德愛(ài)勝蚓體內(nèi)AChE酶活性[25]。由于物種差異性，雖然這些生物對(duì)硒的響應(yīng)濃度不同，但是硒對(duì)AChE酶活的抑制可能存在某些共用途徑。硒本身可以作為抗氧化劑，適量硒可以消除體內(nèi)多余的氧自由基[38]，而神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)等功能對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的依賴性的[39]，暗示硒通過(guò)調(diào)節(jié)自由基水平對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)通路及酶活性產(chǎn)生影響。這也和本研究的結(jié)果吻合，硒暴露2周和2個(gè)月后，AChE酶活性的變化趨勢(shì)和TBARS的變化趨勢(shì)基本吻合(特別是2～20 μg·g-1區(qū)間)，相關(guān)性分析也顯示二者存在一定程度的線性關(guān)系(圖3)，進(jìn)一步表明AChE酶活性可能受到氧自由基水平的調(diào)控。

圖3 霍甫水絲蚓體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平和乙酰膽堿酯酶活性相關(guān)性分析Fig. 3 The correlation analysis between the levels of TBARS and the activities of AChE in L. hoffmeisteri

2.3 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓消化酶活性的影響

硒暴露后，硒對(duì)霍甫水絲蚓消化酶活性的影響較小，僅在5 μg·g-1濃度增加了α-葡糖苷酶的活性，隨著濃度升高，其促進(jìn)作用逐漸消失并恢復(fù)到對(duì)照組水平，表明只有適宜濃度的硒才可促進(jìn)其消化酶活性。有趣的是，短期暴露只有Se(Ⅳ)增加了該酶的活性，而長(zhǎng)期暴露后，只有Se(Ⅵ)增加了該酶的活性(圖4)。

圖4 硒暴露對(duì)霍甫水絲蚓對(duì)消化酶活性的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對(duì)照組存在顯著差異， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 4 The effects of selenium exposure on the digestive enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); α-Glu means α-glucosidase.

硒對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物消化酶活性影響的研究相對(duì)較少。已有的研究主要集中于酵母硒對(duì)一些水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的影響，如酵母硒在適宜濃度(0.8～1.6 μg·g-1)可以增加刺參體內(nèi)蛋白酶和淀粉酶活性，而硒濃度過(guò)低(0.2 μg·g-1)或過(guò)高(6.4 μg·g-1)時(shí)酶活性均恢復(fù)到對(duì)照組水平[40]。雖然有研究表明，對(duì)于刺參而言，有機(jī)硒對(duì)消化酶的促進(jìn)作用大于無(wú)機(jī)硒[41]，但自然水體和沉積物中硒主要以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)等形態(tài)存在[9-12]，這些無(wú)機(jī)硒對(duì)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物消化酶的影響可能具有更高的生態(tài)學(xué)意義。硒對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)消化酶活性的促進(jìn)作用，可能和硒對(duì)其代謝、生理狀況和氧化還原等穩(wěn)態(tài)的維持有關(guān)，從而相應(yīng)增加其消化能力。此外，消化酶活性對(duì)不同價(jià)態(tài)硒以及不同暴露時(shí)間的響應(yīng)存在差異，本研究結(jié)果顯示，5 μg·g-1Se(Ⅳ)可以在較短暴露期就增加水絲蚓體內(nèi)α-Glu的活性，而長(zhǎng)期暴露后，Se(Ⅳ)對(duì)該酶的促進(jìn)作用消失，反而5 μg·g-1Se(Ⅵ)才能夠增加該酶的活性。同樣，這可能和不同價(jià)態(tài)硒在生物體內(nèi)的累積速率、代謝速率和生物轉(zhuǎn)化存在差異等因素有關(guān)。例如，前期研究發(fā)現(xiàn)，霍甫水絲蚓在含20～40 μg·g-1濃度Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的沉積相中暴露2個(gè)月后，Se(Ⅳ)暴露組蟲(chóng)體內(nèi)硒含量遠(yuǎn)高于Se(Ⅵ)暴露組，表明不同價(jià)態(tài)硒在水絲蚓體內(nèi)的累積速率存在顯著差異[16]。

綜上所述，2種無(wú)機(jī)硒均可以對(duì)霍甫水絲蚓抗氧化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等造成顯著影響，且存在暴露濃度、暴露時(shí)間及硒價(jià)態(tài)的差異。沉積物中適宜硒含量(2～5 μg·g-1)對(duì)霍甫水絲蚓的生理狀況有益，而高濃度硒(Se(Ⅳ)>5 μg·g-1，Se(Ⅵ)>20 μg·g-1)對(duì)其造成一定的毒性效應(yīng)。硒對(duì)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的生物效應(yīng)受到多種因素的調(diào)節(jié)，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步探討。