沉積物中無機硒對霍甫水絲蚓的生物效應研究

李瀟，李丹，羅藝璇，楊紀琛，劉洪宋，雷浩俊，陳紅星,*，謝凌天

1. 華南師范大學環境研究院，廣東省化學品污染與環境安全重點實驗室，環境理論化學教育部重點實驗室，廣州 510006 2. 華南師范大學環境學院，廣州 510006

沉積物是水體環境污染物的主要的匯，同時沉積物也是底棲動物生活的主要場所，底棲動物通過生物擾動等可加速污染物從沉積物向水體的遷移，使得沉積物成為水體污染物的源[1]。此外，沉積物也是多種等寡毛綱底棲動物的主要食物來源，其通過吞吐和消化沉積物，從沉積物中獲取有機質等食物，但其中的污染物也常常被攝入體內，對生物體及水生食物鏈造成潛在危害和風險[2-3]。

硒是動物體必需微量元素之一，低劑量硒常具有拮抗氧化應激的作用，并抑制親巰基二價金屬離子的生物累積和毒性(如汞、鎘和鉛等)，但是過量硒對生物體又可產生一定的毒性效應[4-7]。研究顯示，對于無脊椎動物而言，過量硒的毒性和汞毒性相當，且遠大于鎘的毒性[8]。水體中硒主要以無機硒形態存在，其中主要是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)[9]，土壤及沉積物中無機硒主要形態也以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)為主[10-12]。研究表明，沉積物中硒主要分布于表層(～90%)，硒濃度一般低于1 μg·g-1(干質量)，并隨深度降低(如深度30 cm處濃度僅～0.3 μg·g-1干質量)，而富硒或硒污染底棲環境硒濃度可達4～30 μg·g-1(干質量)[13]。痕量元素的遷移性和生物可利用性與其化學形態密切相關，序列提取分析表明，硒非殘渣態在總含量中所占的比例相對較高，有著較高的生物可利用性和潛在生態風險[10-11]。

底棲動物群落的穩定性，在很大程度上反映了整個水生態系統的健康程度[14]。底棲動物定量定點采集容易，其運動不敏捷，可真實反映固定區域的污染水平，其種類的多樣性比魚類大，對水體污染的耐受性和適應性因種類或分類群的不同而有較大變化，因而底棲動物可在河流生態評價中用作指示生物，歐美國家也已將底棲動物作為水質指示動物[15]。此外，通過底棲動物進行生物監測可了解到水質的長期變化，綜合表征污染物的毒性。水環境中部分搖蚊幼蟲[1]和寡毛綱少數種(如霍甫水絲蚓)等被廣泛用來作為水體污染指示生物[2]。

食物相硒是過量硒毒性的主要作用途徑[5, 16]。底棲食物網中，水體底棲生物中的硒是食物鏈硒傳遞和累積的重要一環[17]。霍甫水絲蚓為底棲環境的優勢種之一，作為耐污種在水生態評價中具有重要地位[16,18]。以往研究多認為底棲動物對污染物耐受性較高，其本身只是作為污染物在食物鏈中傳遞的媒介，其本身受到的影響研究很少。我們前期探討了霍甫水絲蚓對沉積物中無機硒的擾動作用，發現霍甫水絲蚓可以通過打洞和攝食等方式改變沉積物/水界面硒的分布[16]。反之，沉積物中無機硒是否對其中的底棲動物造成一定的生態風險有待研究。因此，本研究將典型底棲動物霍甫水絲蚓暴露于2種無機硒(Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ))，通過測定抗氧化系統(TBARS、CAT、SOD和GST)、神經系統(AChE)和消化系統(α-葡糖苷酶)酶活性的變化，探討無機硒對底棲動物的生物效應，為沉積物中無機硒對底棲動物的生態風險評價提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

霍甫水絲蚓購自廣州市水產市場，在實驗室中于18 L玻璃缸中暫養。水絲蚓暴露實驗所用溶液根據ASTM標準進行配制(48 mg·L-1NaHCO3，30 mg·L-1CaSO4·2H2O，30 mg·L-1MgSO4，2 mg·L-1KCl，pH 7.4)。實驗開始1周前挑選體長大致等同的霍甫水絲蚓成體，將水絲蚓轉移至實驗條件下適應環境，每天喂食少量粉末飼料(tetramin)，飼料含粗蛋白>47%，粗脂肪>10%，粗纖維<3%，水分<6%，磷>1%，維生素A>15 000 IU·kg-1，維生素B12 110 mg·kg-1，維生素C 390 mg·kg-1，維生素D3 1 400 IU·kg-1，維生素E 140 IU·kg-1，煙酸700 mg·kg-1，肌醇1 400 mg·kg-1，膽堿2 100 mg·kg-1，生物素>1 mg·kg-1，Omega-3脂肪酸8 000 mg·kg-1。

實驗所需所有容器均在實驗前于50%硝酸溶液中清洗，并由超純水沖洗后烘干使用。亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se(Ⅳ))和硒酸鈉(Na2SeO4·10H2O，Se(Ⅵ))購于Sigma-Aldrich (美國)。

1.2 硒沉積物暴露

實驗所需沉積物取自廣州水源地(113°47'42"N，23°46'01"E)，實驗開始前將沉積物過篩(500 μm)，-80 ℃冷凍殺滅其中的生物，48 h后解凍，沉降并去除上覆水對沉積物進行檢測。沉積物水分含量為56%，總氮(TN)、總磷(TP)、氨(NH4+)和總有機碳(TOC)含量分別為0.15%、0.05%、0.01%和2.1%。烘干后檢測其砂含量為0.5%，粉砂含量為40.8%，黏土含量為58.7%。所用沉積物總硒背景值約為0.2 μg·g-1(干質量)[16]。

本實驗共設置9個處理組：空白對照組，4個Se(Ⅳ)處理組(2、5、20和40 μg·g-1干質量)，4個Se(Ⅵ)處理組(2、5、20和40 μg·g-1干質量)，每個處理組設6個平行，共54個燒杯。其中，3個平行(27個燒杯)用于暴露2周后的測定，另外3個平行用于暴露2個月后的測定。通過計算沉積物含水量，分別向處理組加入一定量對應形態的硒母液并攪拌均勻。室溫條件下平衡48 h，隨后將沉積物分放在酸洗過的1 L玻璃燒杯中，每個燒杯放入約450 g沉積物(濕質量)，沉積物高度約為2.5 cm。每個燒杯加入如上配制的ASTM標準溶液600 mL，并用記號筆標識液面位置。隨后，每個燒杯中放入2 g霍甫水絲蚓(約200條)。光照周期為16 h光照∶8 h黑暗，水絲蚓硒暴露期間不喂食(水絲蚓以沉積物中有機質為食)，不曝氣，每隔2 d加入適量純水(DI水)至標識的液面位置，避免上覆水體積由于揮發等因素造成大幅波動。

暴露2周和2個月后，分別收集各燒杯中的水絲蚓，在干凈的配制水中清空腸道6 h。隨后，用紙拭干水絲蚓體表水分，稱量質量，于-80 ℃冰箱保存，用于各個生化指標的測定。

1.3 生化指標檢測

每個生化指標測定均選取約20 mg水絲蚓，測定采用6個重復(n=6)。將各組織樣品按1∶9質量體積比(1 mg∶9 μL)加入預冷生理鹽水，冰浴勻漿，離心取上清備用。脂質過氧化水平和酶活性測定均采用96孔板法于酶標儀(Tecan Infinite M200)進行測定，根據物質特性選擇相應波段確定其濃度與吸光度的關系，具體步驟參考本實驗室近期研究中的方法進行[19-21]。生化指標包括抗氧化系統中脂質過氧化水平、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性，神經系統中乙酰膽堿酯酶(AChE)活性，以及消化系統中α-葡萄糖苷酶(α-Glu)活性。脂質過氧化水平通過測量硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)含量來確定，結果表示為nmol·mg-1protein。酶活性的單位定義為單位總蛋白濃度對應的酶活性(mU·mg-1protein或U·mg-1protein)，總蛋白濃度用Bradford方法進行測定。

1.4 數據分析

圖中數據為平均值±標準誤差(Mean±SE)，采用GraphPad Prism 8.0對數據進行統計分析和作圖，用Kolmogorov-Smirnov和Levene方法檢驗數據的正態性和方差齊性。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey法進行分析及多重比較(顯著性水平為P<0.05)。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 硒暴露對霍甫水絲蚓抗氧化系統的影響

2.1.1 硒暴露對霍甫水絲蚓脂質過氧化水平的影響

霍甫水絲蚓在硒暴露后，體內脂質過氧化水平(TBARS含量)受到暴露時間的影響較大，而受到價態的影響較小。暴露2周后，水絲蚓體內TBARS水平整體是升高趨勢，在2～20 μg·g-1濃度區間有一個明顯的上升峰值，且在5 μg·g-1和40 μg·g-1這2個濃度處理組顯著升高，5 μg·g-1暴露組遠高于40 μg·g-1暴露組(圖1(A1))；暴露2個月后，TBARS水平在2～20 μg·g-1濃度區間有一個降低的峰值，隨后隨著濃度升高逐漸恢復到對照組水平(圖1(B1))。

水絲蚓體內TBARS水平在暴露2周后升高，可能是由于水絲蚓對于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的應激反應，導致體內脂質過氧化水平升高。無機硒進入水絲蚓體內，進行一系列氧化-還原反應，從而生成過量自由基，造成一定的脅迫效應[3,5,22]。研究表明，夾雜帶絲蚓(Lumbriculusvariegatus)暴露于20 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 2周后，體內TBARS水平顯著升高[3]，而0.6 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露可顯著提高仿刺參(Stichopusjaponicas)體內耗氧率[23]，提示硒的短期暴露對自由基水平的促進作用。隨著暴露濃度的升高，水絲蚓體內TBARS水平并不是線性升高，而僅在5 μg·g-1和40 μg·g-1暴露組顯著高于對照組，且低濃度暴露組(5 μg·g-1)高于高濃度暴露組(40 μg·g-1)，表明5 μg·g-1暴露條件下，水絲蚓對硒的吸收和轉化較為迅速，可能屬于主動吸收階段；而在最高濃度40 μg·g-1條件下，過高的硒濃度可能造成其體內抗氧化系統的損傷，水絲蚓對于硒的吸收轉為被動吸收階段，從而通過降低生物累積因子等[16,24]途徑降低過量硒對生物體的毒性效應。安德愛勝蚓(Eiseniaandrei)通過濾紙接觸法暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 48 h后，其體內TBARS水平也顯著升高，和本研究結果類似，該研究也發現這2種無機硒對蚓體TBARS水平的誘導不是線性變化，而是僅在中間濃度(0.5 μg·cm-2)和最高濃度(5 μg·cm-2)有顯著升高[25]。而暴露2個月后，低濃度硒暴露似乎對水絲蚓有一定的有益作用(2～20 μg·g-1)，表現為脂質過氧化水平的降低，而高濃度又逐漸升高其體內脂質過氧化水平，暗示過量硒暴露條件下，硒有益效應的消失或者毒性效應的出現[4,7]。

2.1.2 硒暴露對霍甫水絲蚓抗氧化酶活性的影響

水絲蚓體內3種抗氧化酶活性(CAT、SOD和GST)在暴露2周后，其變化趨勢相似，但是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組差異明顯。Se(Ⅳ)暴露后，抗氧化酶活性隨著暴露濃度逐漸升高，并在20～40 μg·g-1達到平衡；而Se(Ⅵ)暴露后，抗氧化酶活性在5 μg·g-1達到峰值，并隨后逐漸降低到對照組水平(圖1(A2)～(A4))。有趣的是，硒暴露2個月后，水絲蚓體內3種抗氧化酶的活性基本僅受到硒暴露濃度的影響，而不受硒價態的影響(圖1(B2)～(B4))(除2 μg·g-1處理組的SOD外)，其中，CAT酶活性在5 μg·g-1顯著降低，SOD酶活性在2～5 μg·g-1升高，GST酶活性和對照組沒有差異。

圖1 硒暴露對霍甫水絲蚓抗氧化系統的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對照組存在顯著差異， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 The effects of selenium exposure on the antioxidant system of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); TBARS means thiobarbituric acid reactive substances; SOD means superoxide dismutase; CAT means catalase; GST means glutathione S-transferase.

Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的化學性質不同，可能導致不同價態硒的短期暴露(2周)生物效應差異。二者在生物體內的還原過程雖然類似，但是Se(Ⅵ)需要先被還原為Se(Ⅳ)，然后才能進行下一步的還原過程，同等條件下Se(Ⅵ)可以造成更多的氧自由基的產生[26-27]。因此，可能造成了Se(Ⅵ)在較低濃度如5 μg·g-1即造成了抗氧化酶活性的顯著升高，且隨著Se(Ⅵ)濃度升高，迅速超過機體的抗氧化能力，從而造成抗氧化系統的失衡及抗氧化酶活性的降低；而Se(Ⅳ)的還原可能產生較少的氧自由基，因此Se(Ⅳ)在20 μg·g-1才造成抗氧化酶活性的顯著升高。

暴露2個月后，水絲蚓體內抗氧化酶活性的變化和暴露2周差異較大。類似研究表明，泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)暴露于4.6～18.4 mg·L-1的Se(Ⅳ)2～3 d后，體內抗氧化酶活(SOD、GST等)明顯升高，暴露4 d后恢復到對照組水平[28]；沙蠶(Nereisdiversicolor)暴露于3.7 μg·g-1Se(Ⅳ)5 d后，體內谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性升高，暴露10 d后也恢復到對照組水平[29]，這些研究表明，硒對抗氧化系統的影響受到暴露時間的顯著影響。此外，硒長期暴露后價態的影響幾乎消失，可能和硒的生物轉化和價態變化等因素有關[27]，具體機制有待進一步研究。

2.1.3 硒暴露對霍甫水絲蚓的雙重生物效應

2.1.3.1 有益效應

適量硒對生物體有一定的有益效應，具有抗氧化等作用。本研究顯示，暴露2個月后，水絲蚓體內TBARS水平在2～20 μg·g-1濃度范圍降低。類似研究表明，桑蠶(BombyxmoriL.)在第5幼蟲期后攝食酵母硒(4～32 μg·g-1，7 d)，可增加其體質量及所產幼蠶的數量[30]。硒對多種重金屬的生物累積和毒性還具有拮抗作用，硒可通過抗氧化作用降低金屬產生的過量自由基，硒預暴露可降低銅在夾雜帶絲蚓體內的累積和TBARS水平[6]，還可降低鎘在小鳉魚(Heterandriaformosa)體內的累積和TBARS水平[5]。也有研究認為無機硒如Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)為陰離子，進入生物體后，可和陽離子金屬形成硒-金屬-蛋白復合體，改變金屬對生物大分子的活性位點，降低金屬的毒性效應[31]，如2～10 μg·g-1Se(Ⅳ)可以降低銻元素在赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)體內的累積和毒性[31]；15～50 μg·g-1Se(Ⅳ)可降低夾雜帶絲蚓體內汞的累積(～80%)等[32]。

值得注意的是，硒的有益濃度范圍較窄，并且過高或過低可以引起硒的毒性效應[4]。本研究中霍甫水絲蚓在硒暴露2周和2個月后，在2～20 μg·g-1濃度區間均存在峰值。已有的研究也顯示，刺參(Apostichopusjaponicus)攝食硒餌料28 d，適宜酵母硒濃度(0.8～1.6 μg·g-1)可以提高其免疫能力及抗氧化酶活性，而低濃度(0.2 μg·g-1)和高濃度(3.2～6.4 μg·g-1)均沒有促進作用[33]。蚯蚓(Dendrobaenaveneta)暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 15 d后，CAT只在適宜濃度(0.1 μg·g-1)降低，而在低硒(0.01 μg·g-1)和高硒(1 μg·g-1)濃度均和對照組無差異[34]。這些研究表明，硒作為動物體必需元素之一，其添加量必須控制在一個合理范圍。

2.1.3.2 毒性效應

過量硒對生物體的毒性效應也不容忽視。研究表明，對無脊椎動物如刺參幼參來說，硒和汞同屬于劇毒物質，其毒性遠高于鎘[8]。不少研究報道了過量硒的毒性效應，赤子愛勝蚓暴露于46 μg·g-1Se(Ⅳ) 49 d后，其種群數量降低了約1/3[35]；白蚯蚓(Enchytraeuscrypticus)暴露于6.2 μg·g-1Se(Ⅵ) 28 d后，其種群數量也降低了約50%[36]；秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)暴露于78.9 μg·g-1Se(Ⅳ) 9～55 h后(全生命周期)，不同生長期生長及繁殖均受到抑制[37]。

此外，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)對底棲動物的毒性存在差異。霍甫水絲蚓暴露于硒2個月后，5 μg·g-1Se(Ⅳ)降低了其種群數量約1/4，而>20 μg·g-1Se(Ⅵ)才開始降低其種群數量[16]。在安德愛勝蚓硒的48 h急性毒性實驗中，也發現Se(Ⅳ)的毒性約為Se(Ⅵ)的4.6倍[25]。在過量硒存在的條件下，Se(Ⅳ)對無脊椎動物的毒性高于Se(Ⅵ)，可能和其較高的生物累積速率[16]和較快的生物還原過程等[3]因素相關。

2.2 硒暴露對霍甫水絲蚓神經酶活性的影響

硒暴露2周后，霍甫水絲蚓體內AChE酶活性受影響較小，只有5 μg·g-1Se(Ⅳ)暴露增加了水絲蚓體內AChE酶活性，而暴露2個月后，隨著濃度升高，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)都降低了水絲蚓體內AChE酶活性，且在5～40 μg·g-1達到平衡狀態。總體而言，霍甫水絲蚓體內AChE酶活性幾乎沒有受到硒價態差異的影響。此外，對照組霍甫水絲蚓體內AChE酶活性的平均水平在不同暴露時間段有較大變化，2個月后其體內AChE酶活性普遍高于2周，可能受到不同生長階段的影響(圖2)。

圖2 硒暴露對霍甫水絲蚓神經酶活性的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對照組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 The effects of selenium exposure on the nervous enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control (P<0.05); AChE means acetylcholinesterase.

硒暴露會降低無脊椎動物AChE酶活性的結果已有報道，Se(Ⅳ)可以降低沙蠶(3.7 μg·g-1，5～10 d)[29]和蚯蚓(0.1 μg·g-1，15 d)[34]體內AChE酶活性；Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)可降低安德愛勝蚓體內AChE酶活性[25]。由于物種差異性，雖然這些生物對硒的響應濃度不同，但是硒對AChE酶活的抑制可能存在某些共用途徑。硒本身可以作為抗氧化劑，適量硒可以消除體內多余的氧自由基[38]，而神經系統的信號傳導等功能對氧自由基有很強的依賴性的[39]，暗示硒通過調節自由基水平對神經系統通路及酶活性產生影響。這也和本研究的結果吻合，硒暴露2周和2個月后，AChE酶活性的變化趨勢和TBARS的變化趨勢基本吻合(特別是2～20 μg·g-1區間)，相關性分析也顯示二者存在一定程度的線性關系(圖3)，進一步表明AChE酶活性可能受到氧自由基水平的調控。

圖3 霍甫水絲蚓體內脂質過氧化水平和乙酰膽堿酯酶活性相關性分析Fig. 3 The correlation analysis between the levels of TBARS and the activities of AChE in L. hoffmeisteri

2.3 硒暴露對霍甫水絲蚓消化酶活性的影響

硒暴露后，硒對霍甫水絲蚓消化酶活性的影響較小，僅在5 μg·g-1濃度增加了α-葡糖苷酶的活性，隨著濃度升高，其促進作用逐漸消失并恢復到對照組水平，表明只有適宜濃度的硒才可促進其消化酶活性。有趣的是，短期暴露只有Se(Ⅳ)增加了該酶的活性，而長期暴露后，只有Se(Ⅵ)增加了該酶的活性(圖4)。

圖4 硒暴露對霍甫水絲蚓對消化酶活性的影響注：A表示Se(Ⅳ)暴露組和對照組存在顯著差異，a表示Se(Ⅵ)暴露組和對照組存在顯著差異， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露組存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 4 The effects of selenium exposure on the digestive enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); α-Glu means α-glucosidase.

硒對無脊椎動物消化酶活性影響的研究相對較少。已有的研究主要集中于酵母硒對一些水產動物消化酶的影響，如酵母硒在適宜濃度(0.8～1.6 μg·g-1)可以增加刺參體內蛋白酶和淀粉酶活性，而硒濃度過低(0.2 μg·g-1)或過高(6.4 μg·g-1)時酶活性均恢復到對照組水平[40]。雖然有研究表明，對于刺參而言，有機硒對消化酶的促進作用大于無機硒[41]，但自然水體和沉積物中硒主要以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)等形態存在[9-12]，這些無機硒對底棲無脊椎動物消化酶的影響可能具有更高的生態學意義。硒對水生動物體內消化酶活性的促進作用，可能和硒對其代謝、生理狀況和氧化還原等穩態的維持有關，從而相應增加其消化能力。此外，消化酶活性對不同價態硒以及不同暴露時間的響應存在差異，本研究結果顯示，5 μg·g-1Se(Ⅳ)可以在較短暴露期就增加水絲蚓體內α-Glu的活性，而長期暴露后，Se(Ⅳ)對該酶的促進作用消失，反而5 μg·g-1Se(Ⅵ)才能夠增加該酶的活性。同樣，這可能和不同價態硒在生物體內的累積速率、代謝速率和生物轉化存在差異等因素有關。例如，前期研究發現，霍甫水絲蚓在含20～40 μg·g-1濃度Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的沉積相中暴露2個月后，Se(Ⅳ)暴露組蟲體內硒含量遠高于Se(Ⅵ)暴露組，表明不同價態硒在水絲蚓體內的累積速率存在顯著差異[16]。

綜上所述，2種無機硒均可以對霍甫水絲蚓抗氧化系統、神經系統和消化系統等造成顯著影響，且存在暴露濃度、暴露時間及硒價態的差異。沉積物中適宜硒含量(2～5 μg·g-1)對霍甫水絲蚓的生理狀況有益，而高濃度硒(Se(Ⅳ)>5 μg·g-1，Se(Ⅵ)>20 μg·g-1)對其造成一定的毒性效應。硒對底棲無脊椎動物的生物效應受到多種因素的調節，其內在機制有待進一步探討。